植物与放射性示踪剂测量矿质营养和毒物的通量

摘要

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

摘要

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

引言

营养物质和有毒物质的吸收和分布强烈地影响植物生长。因此，底层传输过程对调查构成的植物生物学和研究农业科学^1,2的一个主要领域，特别是在营养优化和环境压力的环境中（ 例如 ，盐胁迫，铵毒性）。对于通量植物的测量方法中，最主要是利用放射性同位素示踪物，这是显著在20世纪50年代开发的。（ 例如 ^，3），一直持续到今天被广泛使用。其他方法，如养分耗竭的从根介质和/或积累在组织中，使用的离子选择性微电极的振动测量，如MIFE（微电极的离子通量的估计）和SIET（扫描离子选择性电极法），并使用离子选择性荧光染料，也被广泛应用，但在他们的检测净感能力是有限XES（ 即 ，流入和流出之间的差异）。使用放射性同位素的，另一方面，允许研究者的独特能力来分离和量化单向通量，这可以被用来解决动力学参数（ 例如 ，K _M和V _max）和洞察能力，热力学，机制的运输系统和调节。与放射性示踪剂制成单向磁通测量条件下在相反的方向上的磁通量是高下特别有用的，并且细胞内池的周转迅速^4。此外，放射性示踪方法允许较高的底物浓度下进行测量时，与许多其它的技术（参见"讨论"，下同），因为所跟踪的同位素是针对相同的元件的另一同位素背景观察。

这里，我们提供的单向和n中的放射性同位素的测量的详细步骤矿质营养等通量和毒物的完整植株。重点是对钾（K +）通量测量，植物大量营养5，和氨/铵制成（NH 3 / NH 4 +），另一个常量营养素是，然而，中毒性时在高浓度下（ 例如本，1 10毫米）2。我们将用放射性同位素42的K +（叔2 = 12.36小时）和13 NH13分之3NH 4 +（T 2 = 9.98分钟），分别在该模型系统中的大麦的完整的苗（ 大麦 Ļ ），在两个关键协议的描述:通过示踪剂流出（CATE）直接流入（DI）和室分析。我们应该注意到，从本文简单介绍了需要执行的每个协议的步骤开始。每种技术在适当的时候，提供计算和理论的简要说明，但详细的论述，的背景和理论能够在这个问题4,6-9几个关键物品被发现。重要的是，这些协议大致上可转移到磁通的其他营养素/毒物分析（ 例如 ，24的Na +，22的Na +，86 Rb的+，13 NO 3 - ）和其它植物物种的，尽管有一些需要说明的（参见下文） 。我们还强调，放射性物质工作的所有研究者必须在通过自己的机构的电离辐射安全监管机构设置许可工作的重要性。

研究方案

1，植物文化和准备

1. 大麦种植水培苗7天的气候控制生长室（详见^10）。
   注意:要考虑审查的植物在不同的发育阶段，因为营养需求会随着年龄的变化是很重要的。
2. 前一天的实验，捆绑了几个苗在一起，使一个单一的重复（每包3植物的DI，每束6植物CATE）。丛苗通过包装有2厘米件聚乙烯管的周围芽的基部，并确保管道用胶带来创建一个"围脖"。
   注:每捆植物的数目可以根据实验条件^10,13,14而有所不同。集束做是为了提高统计和测量精度，特别是当根质量和/或比活性也低。

2，准备实验方案/材料

内容">注:以下是典型的执行前1天的实验。

1. 对于直接投资，备齐下列各项:预贴标，标签和解吸的解决方案（详见^11），离心管（离心式脱水干燥的植物样品），和样品瓶（植物材料和比活度[S _O;见下文]）。曝气和混合所有的解决方案。
2. 对于美食，备齐下列各项:嗯混合，加气的标签和洗脱解决方案（有关详细信息，请参阅第^10），外排液漏斗，离心管（离心式脱水干燥的植物样品），和样品瓶（为洗脱液，植物样品，并确定_S 0和稀释因子[D _F;见下文]）。

3，放射性示踪剂准备

注意:以下的安全步骤，应先与放射性工作的措施。

1. 确保radioac的要求略去材料许可被理解和遵守。穿戴适当的安全设备（ 如护目镜，手套，实验室外套，铅背心/领）和剂量计（ 例如 ，TLD环和徽章）。设置屏蔽（ 即有机玻璃和铅砖），并执行它后面的放射性工作。确保盖革 - 米勒计数存在以定期监测污染。
2. ⁴² K的制备⁺
   1. 放置在天平上一个干净，干燥的烧杯中。零余额。
   2. 从包装中取出示踪剂小瓶^（42 K ₂ CO ₃ 20毫居里，呈粉末状）和倒示踪剂放入烧杯中。注意质量的。
   3. 吸取19.93毫升DH _{2 O，}随后0.07毫升H ₂ SO _4，放入烧杯中。这将推动下列化学反应:
      ^42，K ₂ CO ₃的 （S）+ H ₂ SO _4（L）+ H _{2 ^{O（L）→42}} K ₂ SO ₄ （L）+ CO _2（V）+ 2H _{2 O（L）}
   4. 计算出的放射性原液的浓度，给定的K ₂ CO ₃的质量和分子量，并且体积（20毫升）中。
      注:如果有¹³的NH _3月 ^13日 NH ₄ ⁺的示踪剂是产于通过水的氧原子的质子轰击回旋加速器工作（通常产生100-200毫居里活动;生产的详细信息，请参阅第^12）。由于¹⁴ NH ^{_{十四分之三}} NH ⁺ ₄的量是非常低的，这些解决方案中，N浓度的储备溶液是可以忽略不计。

4，直接流入（DI）测量

1. 为⁴² K ^+，吸取放射性原液到达K ⁺的所需最终浓度为标记溶液所需的量。
   1. 为¹³的^{_{NH13分之3NH} +} _4，吸管少量（<0.5毫升）到标记溶液。允许的标签解决方案，以充分混匀（通过曝气）。
2. 吸管标签解决方案1毫升子样品放入样品瓶（共4个样本）重复3次。
   1. 测量放射性小瓶（在"每分钟计数"，CPM），用γ计数器。确保该计数器进行编程，使得每分钟的读数被用于校正同位素衰变（这是针对这样短暂的示踪剂特别重要）。
   2. 通过计算四个样本的计数（CPM毫升^-1），通过底物的浓度在溶液中除（微摩尔毫升^-1）计算_S 0（表示为每分钟微摩尔^-1）。
3. 沉浸在预标记（非放射性）溶液根部5分钟，进行预平衡的植物在试验条件下（见例如 ^，10,13,14为变化前的标签时）。
4. 沉浸在根标签（放射性）溶液中5分钟。
   注:标注时间可以根据实验^3,4,7-10而有所不同。
5. 传送根部到解吸溶液中5秒以去除大量的表面附着的放射性。转移的根放入的解吸液的第二烧杯5分钟以外示踪剂进一步明确根。
6. 解剖和独立笋，竹笋基部和根。
7. 在低速放置于离心管中，根和自旋的样品30秒，临床级离心机（〜5000 XG），以除去表面和间隙水。
8. 称取根（鲜重，FW）。
9. 放射性计数植物样品中（拍摄，拍摄基础和根本，见步骤4.2.1）。
10. 计算的通量。使用下面的公式计算出流入到植物
    Φ= Q * / _S 0重量_Ł
    其中Φ是通量（微摩尔克^-1小时^-1），Q *为示踪剂在组织中累积的量（CPM，通常在根，芽，和基底的拍摄，结合），S _o为标记溶液（CPM微摩尔的比活性^{- 1），w}是根鲜重（g），而t _L是标记时间（hr）。
    注:更复杂的计算可以由标签和解吸过程中考虑到从根部同时示踪剂流出的基础上，从CATE获得的参数（见下文;有关详细信息，请参阅第^4）。

5，房室分析示踪流出（CATE）测量

1. 准备标签解决方案和措施_，S 0（见步骤4.1 - 4.2以上）。
2. 测量稀释因子（D _F）。
   注意:通常情况下，相对于所述检测器中的γ射线计数样品的位置可以影响量辐射测量。详情请参阅讨论。
   1. 测定_S 0后，添加19为h毫升_{2 O}到各样品（使得最终体积=洗脱液体积= 20毫升）中。放射性计数每20毫升样品中（见步骤4.2.1）。
   2. 通过将1毫升样品的平均CPM由20毫升样品的平均CPM计算D _F。
3. 沉浸在标签解决方案的根为1小时。
4. 从标签解决方案和转让植物去除植物外排液漏斗中，确保所有根材料的漏斗内。要流出漏斗一侧轻轻的安全设备通过应用一小片胶带在塑料套。
5. 轻轻倒出所述第一洗脱液进入漏斗。启动定时器（计数）。
6. 打开该轴颈和后15秒收集在样品瓶的洗脱物（注:洗脱时间会有所不同，见下文）。关闭插口。轻轻倒出下一洗脱液进入漏斗。
7. Repea吨步骤5.6的溶出系列，其中如下，从第一到最后的洗脱物的剩余部分:15秒（4次），20秒（3倍），30秒（两次），40秒（一次），50秒（一次），1分钟（25次），为29.5分钟的总洗脱时间
   注:解吸系列可根据实验条件^7-10,13,14而有所不同。
8. 一旦洗脱协议完成后，收获的植物（步骤4.6 - 4.8以上）。
9. 计数放射性洗脱液和植物样品中的伽马射线计数器（阅读每个洗脱液用D _F相乘，见5.2）。
10. 情节示踪剂释放（CPM克（根^FW）-1分^-1）为洗脱时间的函数。对于稳态条件下，进行线性回归和通量计算，半衰期交流和池大小（详见^6-9）。

结果

图1示出了使用DI技术^（13 N）中的等温线，用于NH ₃的流入，在高生长完好大麦幼苗的根部（10毫米）的NH ₄ ^+，和任一低（0.02毫摩尔）或高（5毫）K ^+。的等温线显示米氏动力学时NH ₃通量被绘制为外部的NH ₃浓度（[NH _{3]分机号码} ;可以通过改变调节溶液的pH ^13）的函数。 NH ₃通量分别为显著更高的低K ⁺

讨论

这表现在上面的例子中，放射性示踪方法是一个功能强大的测量营养素和有毒物质在植物中的单向磁通的装置， 图1示出的NH ₃流入可超过225微摩尔克^-1小时^-1，这也许是达到最高善意的跨膜通量曾报道在植物中的系统^13，但是，如果测定仅净通量这个磁通量的大小将是不可见的。这是因为，NH ₃的大流出发生在同一时间涌入，在徒劳...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gamma counter	Perkin Elmer		Model: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counter	Ludlum Measurements Inc.		Model 3 survey meter
400 ml glass beakers	VWR	89000-206	For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnel	VWR	89000-466	For efflux funnel
Large tubing	VWR	529297	For efflux funnel
Medium tubing	VWR	684783	For bundling
Small tubing	VWR	63013-541	For aeration
Aeration manifold	Penn Plax Air Tech	vat 5.5	To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vials	VWR	66022-128	For gamma counting
Glass centrifuge tubes	VWR	47729-576	For spin-drying root samples
Kimwipes	VWR	470173-504	For spin-drying root samples
Dissecting scissors	VWR	470001-828
Forceps	VWR	470005-496
Low-speed clinical centrifuge	International Equipment Co.	76466M-4	For spin-drying root samples
1 ml pipette	Gilson	F144493
10 ml pipette	Gilson	F144494
1 ml pipette tips	VWR	89079-470
10 ml pipette tips	VWR	89087-532
Analytical balance	Mettler toledo	PB403-S/FACT