Измерение потоков минеральных питательных веществ и токсикантов в растениях с помощью радиоактивной метки

Резюме

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Аннотация

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Введение

Поглощение и распределение питательных веществ и токсикантов сильно влияют на рост растений. Соответственно, исследование основных транспортных процессов является одним из основных область исследований в биологии растений и сельскохозяйственных наук ^1,2, особенно в контекстах питательной оптимизации и экологических стрессов (например, соль стресс, токсичность аммония). Главным среди методов для измерения потоков в растениях является использование радиоизотопных индикаторов, которая была разработана значительно в 1950 (смотри, например, ³⁾ и продолжает быть широко используется сегодня. Другие методы, такие как измерения истощение питательных веществ из корневой среды и / или накопления в тканях, использование ионно-селективных вибрирующих микроэлектродов, такие как MIFE (микроэлектродной ионный оценки потока) и SIET (сканирование ионоселективная техники электрод), и использования ион-селективный флуоресцентные красители, также широко применяется, но ограничены в их способности обнаружить чистую гриппаРЭС (т.е. разница между притоком и оттоком). Использование радиоизотопов, с другой стороны, позволяет исследователю уникальную возможность изолировать и количественно однонаправленные потоки, которые могут быть использованы для решения кинетических параметров (например, К _М и V _макс), и дать представление о мощности, энергетика, механизмы и регулирование, транспортных систем. Однонаправленные измерения потока, сделанные с радиоактивных индикаторов являются особенно полезными в условиях, когда поток в противоположном направлении высока, а оборот внутриклеточных пулов происходит быстро ^4. Кроме того, радиоиндикаторные методы позволяют измерять, которые будут проводиться в довольно высоких концентрациях субстрата, в отличие от многих других методов (см 'Обсуждение', ниже), так как прослеживается изотоп наблюдается на фоне другого изотопа того же элемента.

Здесь мы предоставляем подробные инструкции для радиоизотопного измерения однонаправленной и пET потоки минеральных питательных веществ и токсикантов в целые растения. Акцент будет сделан на измерении потока калия (K ^+), растительного макро- ⁵ и аммиака / аммония (NH ₃ / NH ₄ ^+), другой макроэлементов, которые, однако, токсичным, когда он присутствует в высоких концентрациях (например, 1- 10 мМ) ^2. Мы будем использовать радиоизотопы ⁴² K ⁺ (т _1/2 = 12,36 ч) и ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ⁺ (т _1/2 = 9,98 мин), соответственно, в неповрежденных саженцев модель системы ячменя (Hordeum обыкновенной L .), в описании двух основных протоколов: прямой приток (DI) и полигамное анализа индикаторного оттока (CATE). Отметим, с самого начала, что эта статья просто описывает шаги, необходимые для выполнения каждого протокола. Где это уместно, краткие пояснения расчетов и теории предоставляются, но подробные экспозиции каждой техники'Ы фона и теория может быть найден в нескольких ключевых статей на эту тему ^4,6-9. Важно отметить, что эти протоколы в целом подлежит передаче потока анализ других питательных веществ / токсикантов (например, Na ^{+, 24, 22} Na ^+, Rb ^{+ 86, 13} NO ₃ ^-) и других видов растений, хотя и с некоторыми оговорками (смотри ниже) . Мы также подчеркиваем важность того, чтобы все исследователи, работающие с радиоактивными материалами должны работать в соответствии с лицензией, расположенной через ионизирующего регулятора радиационной безопасности их учреждения.

протокол

1 завод Культура и подготовка

1. Вырастить ячменя гидропонике в течение 7 дней в камере роста климат-контролем (подробнее см ^10).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно рассмотреть вопрос об изучении растений на различных стадиях развития, как питательные требования будут меняться с возрастом.
2. За день до экспериментов, расслоение несколько саженцев вместе, чтобы сделать единый копировщика (3 растения в пачку для DI, 6 заводов в пачку для ЗАТО). Bundle саженцы, обернув 2-см кусок Tygon трубки вокруг базальной части побегов, и обеспечение трубку с лентой, чтобы создать "воротник".
   ПРИМЕЧАНИЕ: Число растений в пачке может изменяться в зависимости от условий эксперимента ^10,13,14. Комплектация делается для улучшения статистики и точность измерения, особенно когда корневой массы и / или удельная активность низкая.

2 Получение экспериментальных решений / Материалы

Содержание "> Примечание: В следующем обычно выполняется за 1 день до эксперимента.

1. Для DI, собрать следующее: Pre-маркировки, этикетирования и десорбции решения (подробнее см ^11), центрифугирования труб (для спин-сушки образцов растений), и ампулами (для растительного материала и удельной активности [S _°; смотри ниже]). Аэрацию и смешать все решения.
2. Для ЗАТО, собрать следующие: Хорошо смешанная, газобетон маркировки и элюирования решения (подробнее см ^10), эффлюксных воронки, центрифугирования труб (для спин-сушки образцов растений) и примеров флаконов (для элюатов, образцы растений, и определение S _о и коэффициент разбавления [D _F; ниже]).

3 Подготовьте радиоиндикаторные

ВНИМАНИЕ: Следующие шаги безопасности должны быть приняты до начала работы с радиоактивностью.

1. Убедитесь, что требования радиоакный материалы лицензия понимаются и последовал. Надевайте оборудование для обеспечения безопасности (т.е., очки, перчатки, лабораторный халат, свинец жилет / воротник) и дозиметры (например, TLD кольцо и значок). Настройка защиты (т.е., оргстекло и свинцовые кирпичи) и выполнять радиоактивный работу за ним. Убедитесь, что счетчик Гейгера-Мюллера присутствует для того, чтобы регулярно контролировать на предмет загрязнения.
2. Подготовка ⁴² K ⁺
   1. Поместите чистую, сухую мензурку на баланс. Нулевой баланс.
   2. Удалить пузырек индикатора (20 мКи ⁴² K ₂ CO _3, в виде порошка) из упаковки и залить трассирующими в стакан. Обратите внимание на массы.
   3. Внесите 19,93 мл дН ₂ O, а затем 0,07 мл H ₂ SO _4, в стакан. Это будет стимулировать следующую химическую реакцию:
      ⁴² K ₂ CO ₃ (Ы) + H ₂ SO ₄ (L) + H ₂ O (L) → ⁴² K ₂ SO ₄ (Л) + CO ₂ (V) + 2H ₂ O (л)
   4. Рассчитайте концентрацию радиоактивного раствора, учитывая массу и молекулярную массу K ₂ CO _3, и объем (20 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с ¹³ NH ^_3/13 NH ₄ ⁺ трассирующими производится в циклотроне через протонного облучения атома кислорода воды (как правило, в результате 100-200 мКи деятельности; для производства деталей, увидеть ^12). Поскольку количество ¹⁴ NH ^_3/14 NH ₄ ⁺ чрезвычайно низка в этих растворах, концентрация Н из маточного раствора можно пренебречь.

4 Прямая Приток (DI) Измерение

1. Для ⁴² K ^+, пипетки количество радиоактивного раствора, необходимое для достижения желаемого конечного концентрацию K ⁺ в маркировке решения.
   1. Для ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ^+, пипетку небольшое количество (<0,5 мл) в растворе маркировки. Разрешить маркировки решение тщательно перемешать (через аэрации).
2. Пипетки 1 мл подвыборки маркировки раствора в пробирку образца и повторить три раза (4 образцы в общей сложности).
   1. Измерьте радиоактивности во флаконах (в "импульсов в минуту", CPM), с помощью гамма-счетчика. Убедитесь, что счетчик запрограммирован таким образом, что качения показания корректируются для изотопного распада (это особенно важно для таких короткоживущих индикаторов).
   2. Рассчитать С _О (в виде копий в минуту мкмоль ^-1) путем усреднения подсчеты четырех образцов (CPM мл ^-1) и деления на концентрации субстрата в растворе (мкмоль мл ^-1).
3. Погрузите корни в предварительно маркировки (нерадиоактивного) решения в течение 5 мин, предварительно уравновесить растений в условиях испытаний (смнапример, ^10,13,14 для изменения во времени предварительно этикетки).
4. Погрузите корни в маркировке (радиоактивного) решения в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: раз Маркировка может меняться в зависимости от эксперимента ^3,4,7-10.
5. Трансфер корни десорбции решения в течение 5 сек, чтобы удалить большую часть поверхности-придерживаясь радиоактивности. Передача корни во второй стакан десорбирующего раствора в течение 5 мин и далее четких корней внеклеточного индикатора.
6. Проанализируйте и отдельные побеги, прикорневых побегов, и корни.
7. Поместите корни в центрифужные пробирки и образцы спина в течение 30 сек в низкой скорости, клинико-класса центрифуги (~ 5000 XG) для удаления поверхностных и иловой воды.
8. Взвесьте корни (сырого веса, FW).
9. Количество радиоактивности в пробах растений (стрелять, базального побега, и корня, см шаг 4.2.1).
10. Вычислить поток. Рассчитать приток в растение по формуле
    Φ = Q * / S _о мас _L
    где Φ является поток(Мкмоль г ^-1 ч ^-1), Q * является количество примеси накапливаются в ткани (копий в минуту, как правило, в корне, стрелять, и базальная стрелять, комбинированные), S _о является удельная активность маркировки решения (CPM мкмоль ^{- 1),} W есть корень свежий вес (г), а T _L это время маркировка (HR).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более сложные вычисления можно сделать для учета одновременного индикаторного истечения от корней во время маркировки и десорбции, на основе параметров, полученных из ЗАТО (см ниже; подробнее см ^4).

5 полигамное Анализ Tracer отток (CATE) измерения

1. Приготовьте раствор маркировки и мера S _о (см шаги 4,1 - 4,2, выше).
2. Измерьте коэффициент разбавления (D _F).
   Примечание: Часто, положение образца относительно детектора в гамма-счетчике может влиять на количествоизлучения измеряется. Смотреть обсуждение для деталей.
   1. После измерения С _О, добавить 19 мл H ₂ O к каждому образцу (таким образом, чтобы конечный объем = элюат объем = 20 мл). Количество радиоактивности в каждой пробе 20 мл (этап 4.2.1).
   2. Расчет D _F делением средней СРМ в 1-мл образцы средним импульсов в минуту на 20-мл пробы.
3. Погружают корни в маркировке раствора в течение 1 часа.
4. Удалить растения от решения маркировки и передачи растений отток воронку, обеспечивая весь корень материал в воронку. Мягко безопасные растения в стороне оттока воронку, применяя небольшую полоску ленты на пластиковой втулкой.
5. Аккуратно вылейте первый элюат в воронку. Включить таймер (подсчитывая).
6. Откройте кран и соберите элюат в пробирку образца после 15 сек (примечание: время элюирования будет меняться, смотрите ниже). Закройте кран. Аккуратно влить следующий элюата в воронку.
7. RepeaT шаг 5,6 в течение оставшейся части серии элюции, которое следует ниже, от первого до конечного элюата: 15 сек (четыре раза), 20 сек (три раза), 30 сек (дважды), 40 секунд (один раз), 50 секунд (один раз), 1 мин (в 25 раз), на общую элюции периода 29,5 мин
   ПРИМЕЧАНИЕ: десорбция серии может меняться в зависимости от условий эксперимента ^7-10,13,14.
8. После того, как протокол элюирование завершена, урожай растений (шаги 4,6 - 4,8, выше).
9. Количество радиоактивности в элюатов и растительных образцов в гамма-счетчике (умножения гороскоп для каждого элюата путем D _F, см 5,2).
10. Участок Tracer выпуск (CPM г (кубический FW) ^-1 мин ^-1) в виде функции времени элюирования. Для стационарных условиях, выполнять линейные регрессии и расчеты потоков, период полураспада валют и размеры пула (подробнее см ^6-9).

Результаты

На рисунке 1 показаны изотермы найденные с помощью техники DI (с ¹³ N), для притока NH ₃ в корни интактных проростков ячменя, выращенных при высокой (10 мМ) NH ₄ ^+, и либо низкий (0,02 мм) или высокой (5 мМ ) K ^+. Изотермы отображения Михаэлис-Ментен кинетики, когда NH...

Обсуждение

Как показано в приведенных выше примерах, метод радиотрейсера является мощным средством измерения однонаправленных потоков питательных веществ и токсикантов в Планта. Рисунок 1 показывает, что NH ₃ приток может достигать свыше 225 мкмоль г ^-1 ч ^-1, которая яв...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gamma counter	Perkin Elmer		Model: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counter	Ludlum Measurements Inc.		Model 3 survey meter
400 ml glass beakers	VWR	89000-206	For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnel	VWR	89000-466	For efflux funnel
Large tubing	VWR	529297	For efflux funnel
Medium tubing	VWR	684783	For bundling
Small tubing	VWR	63013-541	For aeration
Aeration manifold	Penn Plax Air Tech	vat 5.5	To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vials	VWR	66022-128	For gamma counting
Glass centrifuge tubes	VWR	47729-576	For spin-drying root samples
Kimwipes	VWR	470173-504	For spin-drying root samples
Dissecting scissors	VWR	470001-828
Forceps	VWR	470005-496
Low-speed clinical centrifuge	International Equipment Co.	76466M-4	For spin-drying root samples
1 ml pipette	Gilson	F144493
10 ml pipette	Gilson	F144494
1 ml pipette tips	VWR	89079-470
10 ml pipette tips	VWR	89087-532
Analytical balance	Mettler toledo	PB403-S/FACT