מדידת שטפים של חומרים מזינים ומינרליים רעלים בצמחים עם חומרים רדיואקטיביים

Summary

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Abstract

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Introduction

הספיגה וההפצה של חומרים מזינים ורעלים משפיעים במידה רבה גידול צמחים. בהתאם לכך, חקירתם של תהליכי העברה הבסיסיים מהווה אזור מרכזי של מחקר בביולוגיה צמח ומדעי חקלאות ^1,2, במיוחד בהקשרים של אופטימיזציה התזונתית ולחצים סביבתיים (למשל, מתח מלח, רעילות אמוניום). ראשי בין שיטות למדידה והנתיבים בצמחים הוא השימוש בקליעים נותבים radioisotopic, אשר פותחו באופן משמעותי ב1950s (ראה, למשל, ³⁾ וממשיך להיות בשימוש נרחב כיום. שיטות אחרות, כגון מדידה של דלדול מזין ממדיום השורש ו / או ההצטברות ברקמות, שימוש בmicroelectrodes רוטט יון סלקטיבי כגון MIFE (microelectrode יון הערכת שטף) וSIET (טכניקת אלקטרודה יון סלקטיבי סריקה), ושימוש של צבעי ניאון יון סלקטיבי, גם מיושמים באופן נרחב, אך הם מוגבלים ביכולתם לזהות שפעת נקיXES (כלומר, ההבדל בין הזרם וזרימה). השימוש ברדיואיזוטופים, לעומת זאת, מאפשר לחוקר את היכולת הייחודית לבודד ולכמת והנתיבים חד כיווני, אשר יכול לשמש לפתרון פרמטרים הקינטית (למשל, K _{M ומקסימום} V), ולספק תובנות הקיבולת, האנרגטיקה, מנגנונים, ורגולציה, מערכות תחבורה. מדידות שטף חד כיווני שנעשו עם radiotracers הן שימושיות במיוחד בתנאים בהם השטף בכיוון ההפוך הוא גבוה, והמחזור של בריכות תאיות הוא ⁴ מהירים. יתר על כן, שיטות radiotracer לאפשר מדידות להתנהל תחת ריכוזי מצע גבוהים למדי, בניגוד לרבי טכניקות אחרות (ראה 'דיון', להלן), כי איזוטופ לייחס הוא ציין על רקע איזוטופ אחר של אותו היסוד.

כאן, אנו מספקים שלבים מפורטים למדידת radioisotopic של חד כיווני וnנתיבי et של חומרים מזינים מינרלים ורעלים בצמחים שלמים. דגש יינתן על מדידת שטף של אשלגן (K ^+), הוא חומר מזין מפעל ^5, ואמוניה / אמוניום (NH _3/4 NH ^+), חומר מזין אחר שהיא, לעומת זאת, רעילה כאשר קיימת בריכוזים גבוהים (למשל, 1 10 מ"מ) ^2. אנו נשתמש ברדיואיזוטופים ⁴² K ⁺ (t _1/2 = 12.36 hr) ^ו13 NH _{^3/13 4} ⁺ (t _1/2 = 9.98 דקות), בהתאמה, בשתילים שלמים של השעורה מערכת מודל (L vulgare Hordeum NH .), בתיאור של שני פרוטוקולים עיקריים: זרם ישיר (DI) וניתוח compartmental על ידי זרימה נותב (קייט). אנחנו צריכים לשים לב מלכתחילה שמאמר זה פשוט מתאר את הצעדים דרושים כדי לבצע כל פרוטוקול. תערוכות שבו מתאים, הסברים קצרים על חישובים והתאוריה מסופקים, אבל מפורטת של כל טכניקהניתן למצוא רקע והתאוריה של 'בכמה מאמרי מפתח בנושא ^4,6-9. חשוב לציין, פרוטוקולים אלה באופן רחב להעברה לשטף ניתוח של חומרים מזינים / רעלים אחרים (למשל, ²⁴ Na ^{+, 22} Na ^{+, 86} Rb ^{+, 13} NO ₃ ^-) ולמיני צמחים אחרים, אם כי עם כמה אזהרות (ראה להלן) . גם אנו מדגישים את החשיבות שכל חוקרי עובדים עם חומרים רדיואקטיביים חייבים לעבוד תחת רישיון מסודר דרך רגולטור בטיחות קרינה מייננת של המוסד שלהם.

Protocol

1 צמח תרבות והכנה

1. לגדול hydroponically שתילי שעורה למשך 7 ימים בתא צמיחת אקלים מבוקר (לפרטים, ראה ^10).
   הערה: חשוב לשקול בחינת צמחים במגוון שלבי התפתחות, כמו דרישות תזונתי תשתנה עם גיל.
2. יום אחד לפני הניסוי, צרור כמה שתילים יחד כדי להפוך לשכפל בודד (3 צמחים לחבילה עבור DI, 6 מפעלים לחבילה לחברות בהסעדה). שתילי Bundle על ידי לפפה חתיכת צינור Tygon 2 סנטימטרים סביב החלק של בסיס יורה, ואבטחת צינורות עם קלטת כדי ליצור "צווארון".
   הערה: מספר הצמחים לחבילה עשוי להשתנות בהתאם ^ל10,13,14 תנאי ניסוי. Bundling נעשה כדי לשפר את הסטטיסטיקה ואת דיוק מדידה, במיוחד כאשר מסת שורש ו / או בפעילות ספציפית היא נמוכה.

2 הכנת פתרונות / חומרי ניסיוני

תוכן "> הערה: הבא מבוצע בדרך כלל ביום 1 לפני ניסויים.

1. עבור DI, לאסוף את הדברים הבאים: טרום התיוג, תיוג, ופתרונות desorption (לפרטים, ראה ^11), צינורות צנטריפוגה (לספין ייבוש של דגימות צמח), ובקבוקוני מדגם (לחומר צמחי ופעילות ספציפית _[o S; ראה בהמשך]). לאוורר ולערבב את כל הפתרונות.
2. לחברות בהסעדה, לאסוף את הדברים הבאים: פתרונות התיוג ובכן מעורב, סודה וelution (לפרטים, ראה ^10), משפכים בזרימת, צינורות צנטריפוגה (לספין ייבוש של דגימות צמח), ובקבוקוני מדגם (לeluates, דגימות צמח, ו נחישות של _o S וגורם לדילול _[f D; ראה להלן]).

.3 הכן radiotracer

זהירות: יש לנקוט לפני העבודה עם רדיואקטיביות צעדי הבטיחות הבאה.

1. ודא שהדרישות של radioacרישיון חומרים מופרז הם הבינו ואחריו. ללבוש ציוד בטיחות מתאים (כלומר, משקפי מגן, כפפות, מעבדה מעיל, אפוד / צווארון עופרת) ומד מינון (לדוגמא, טבעת TLD ותג). הגדר את ההגנה (כלומר, פרספקס ולבני עופרת) ולבצע את העבודה רדיואקטיביים מאחוריה. ודא שמונה גייגר-Müller קיים על מנת לפקח באופן שגרתי לזיהום.
2. הכנת ⁴² K ⁺
   1. מניחים כוס נקייה, יבשה על היתרה. אפס האיזון.
   2. הסר בקבוקון של נותב (20 MCI של ⁴² K ₂ CO _3, בצורת אבקה) מהאריזה ויוצקים נותב לתוך הכוס. שימו לב למסה.
   3. 19.93 מ"ל פיפטה של DH ₂ O, ואחריו 0.07 מ"ל של H ₂ SO _4, לתוך הכוס. זה יניע את התגובה הכימית הבאה:
      ⁴² K ₂ CO ₃ + H (s) ₂ SO ₄ (l) + H ₂ O (l) → ⁴² K ₂ SO ₄ (יב) + CO ₂ (v) + 2H ₂ O (l)
   4. חשב את הריכוז של פתרון מניות רדיואקטיבי, בהתחשב במסה והמשקל מולקולרי של K ₂ CO _3, והנפח (20 מ"ל).
      הערה: אם עובד עם ¹³ NH ^_3/13 NH ₄ ⁺ נותב מיוצר במאיץ חלקיקים באמצעות הפגזת הפרוטון של אטום החמצן במים (בדרך כלל וכתוצאה מכך 100-200 פעילות mCi, לפרטים ייצור, לראות ^12). בגלל כמות ¹⁴ NH ^_3/14 NH ₄ ⁺ היא נמוכה ביותר בפתרונות אלה, ריכוז N של פתרון המניות הוא זניח.

.4 זרם ישיר מדידה (DI)

1. ^ל42 K ^+, פיפטה הסכום של פתרון מניות רדיואקטיבי נדרש כדי להתחבר לריכוז הסופי הרצוי של K ⁺ לתוך פתרון התיוג.
   1. ^ל13 NH _^3/13 NH ₄ ^+, פיפטה כמות קטנה (<0.5 מ"ל) לתוך פתרון התיוג. אפשר פתרון התיוג ולמערבב היטב (באמצעות אוורור).
2. פיפטה תת מדגם 1 מ"ל של תמיסת תיוג לתוך בקבוקון מדגם ולחזור שלוש פעמים (4 דגימות בסך הכל).
   1. למדוד רדיואקטיביות בבקבוקונים (ב" ספירות לדקה ", עותקים לדקה), תוך שימוש בדלפק גמא. ודא שהדלפק מתוכנת כך שקריאות לדקה מתוקנות לריקבון איזוטופי (זה חשוב במיוחד עבור קליעים נותבים קצרים מועד כאמור).
   2. לחשב _o S (מבוטאת ^-1 μmol עותקים לדקה) על ידי חישוב ממוצע הסעיפים של ארבע הדגימות (CPM מ"ל ^-1) וחלוקתו על ידי הריכוז של מצע בפתרון (μmol מ"ל ^-1).
3. לטבול את שורשים בטרום תיוג פתרון (לא רדיואקטיבי) במשך 5 דקות, מראש לאזן צמחים בתנאי בדיקה (ראהלמשל, ^10,13,14 לשינויים בזמן מראש תווית).
4. לטבול את השורשים בתיוג פתרון (רדיואקטיבי) במשך 5 דקות.
   הערה: פעמים תיוג יכולות להשתנות בהתאם לניסוי ^3,4,7-10.
5. העבר את השורשים לפתרון desorption במשך 5 שניות כדי להסיר את חלק הארי של רדיואקטיביות דבקות-משטח. העבר את השורשים לתוך מבחנה שנייה של פתרון desorption למשך 5 דקות לשורשים ברורים נוסף של נותב תאי.
6. לנתח ויורה נפרד, יורה בסיסי, ושורשים.
7. מניחים שורשים בצינורות צנטריפוגה ודגימות ספין ל30 שניות במהירות נמוכה, צנטריפוגות בדרגה קלינית (~ XG 5,000) כדי להסיר לפני שטח ומים ביניים.
8. לשקול שורשים (משקל טרי, FW).
9. רוזן רדיואקטיביות בדגימות צמח (לירות, תירה בסיסי, ושורש; ראה שלב 4.2.1).
10. לחשב את השטף. לחשב זרם לתוך הצמח באמצעות הנוסחא
    Φ = Q _L wt _o * / S
    שבו Φ הוא השטף(Μmol ^-1 שעות ^-1 ז), ש * היא כמות נותב הצטברו ברקמות (CPM, בדרך כלל בשורש, לירות, ולירות בסיסיים, משולב), _o S היא הפעילות הספציפית של פתרון התיוג (μmol עותקים לדקה ^{- 1),} w הוא משקל השורש הטרי (ז), _וL t הוא זמן התיוג (שעה).
    הערה: חישוב מתוחכם יותר יכולה להתבצע לחשבון לזרימה נותב בו זמנית מהשורשים במהלך התיוג וdesorption, המבוססת על פרמטרים המתקבלים מקייט (ראה בהמשך, לפרטים, ראה ^4).

.5 Compartmental ניתוח על ידי זרימת מדידת Tracer (קייט)

1. הכן פתרון תיוג _וo S המידה (ראה צעדים 4.1-4.2, לעיל).
2. למדוד גורם לדילול _(ו ד).
   הערה: לעתים קרובות, את עמדתו של המדגם ביחס לגלאי בדלפק גמא יכולה להשפיע על הכמותקרינה שנמדד. ראה דיון לפרטים.
   1. לאחר מדידת _o S, להוסיף 19 מ"ל של H ₂ O לכל דגימה (כגון שנפח סופי = נפח eluate = 20 מ"ל). רוזן רדיואקטיביות בכל דגימת 20 מ"ל (ראה שלב 4.2.1).
   2. לחשב _f D על ידי חלוקת עותקים לדקה הממוצעת של דגימות 1 מ"ל על ידי העתקים הממוצע של דגימות 20 מ"ל.
3. לטבול את השורשים בפתרון תיוג עבור שעה 1.
4. הסר צמחים מצמחי פתרון תיוג והעברה לזרימת משפך, הבטחה שכל חומר השורש הוא בתוך המשפך. בעדינות צמחים מאובטחים לצד השני של משפך בזרימת על ידי יישום פס קטן של קלטת מעל צווארון הפלסטיק.
5. בעדינות יוצק את eluate הראשון לתוך המשפך. הפעלת טיימר (ספירה קדימה).
6. פתח את הברז ולאסוף את eluate בבקבוקון המדגם לאחר 15 שניות (הערה: זמן elution ישתנה, ראה להלן). סגור את הברז. בעדינות יוצק את eluate הבא לתוך המשפך.
7. Repeaצעד לא 5.6 לשארית סדרת elution, העוקבת, מהראשון לeluate הסופי: 15 שניות (ארבע פעמים), 20 שניות (שלוש פעמים), 30 שניות (פעמיים), 40 שניות (פעם אחת), 50 שניות (פעם אחת), 1 דקות (25 פעמים), לתקופה elution כוללת של 29.5 דקות
   הערה: סדרת Desorption יכול להשתנות בהתאם לתנאי ניסוי ^7-10,13,14.
8. ברגע שפרוטוקול elution הושלם, צמחי קציר (שלבים 4.6-4.8, לעיל).
9. רוזן רדיואקטיביות בeluates ודגימות צמח בדלפק גמא (הכפלת הקריאה עבור כל eluate ידי _f D, לראות 5.2).
10. שחרור עלילה נותב (ז עותקים לדקה (FW שורש) ^-1 דקות ^-1) כפונקציה של זמן elution. לתנאי מצב יציב, לבצע רגרסיות ליניארי וחישובים של נתיבים, זמן מחצית חיים של חליפין, וגדלים בריכה (לפרטים, ראה ^6-9).

תוצאות

איור 1 מציג איזותרמות מצאו שימוש בטכניקת DI (עם ¹³ N), לזרם של NH ₃ לשורשים של שתילי שעורה שלמים גדלו בגבוה (10 מ"מ) NH ₄ ^+, וגם נמוך (0.02 מ"מ) או גבוה (5 מ"מ ) K ^+. איזותרמות להציג קינטיקה מיכאליס-מנטן כאשר NH ₃ נתיבים הם זממו כפונקציה ...

Discussion

כפי שמודגם בדוגמאות לעיל, שיטת radiotracer היא אמצעי רב עוצמה למדידה והנתיבים חד כיווני של חומרים מזינים ורעלים בPlanta. איור 1 מראה כי NH ₃ זרם יכול להגיע מעבר לשעתי 225 μmol ^-1 גרם ^-1, שהוא אולי השטף הטרנסממברני תום הלב הגבוה ביותר שדווח אי פעם ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gamma counter	Perkin Elmer		Model: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counter	Ludlum Measurements Inc.		Model 3 survey meter
400 ml glass beakers	VWR	89000-206	For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnel	VWR	89000-466	For efflux funnel
Large tubing	VWR	529297	For efflux funnel
Medium tubing	VWR	684783	For bundling
Small tubing	VWR	63013-541	For aeration
Aeration manifold	Penn Plax Air Tech	vat 5.5	To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vials	VWR	66022-128	For gamma counting
Glass centrifuge tubes	VWR	47729-576	For spin-drying root samples
Kimwipes	VWR	470173-504	For spin-drying root samples
Dissecting scissors	VWR	470001-828
Forceps	VWR	470005-496
Low-speed clinical centrifuge	International Equipment Co.	76466M-4	For spin-drying root samples
1 ml pipette	Gilson	F144493
10 ml pipette	Gilson	F144494
1 ml pipette tips	VWR	89079-470
10 ml pipette tips	VWR	89087-532
Analytical balance	Mettler toledo	PB403-S/FACT