Mesurer les flux d'éléments nutritifs et des substances toxiques minéraux dans les usines avec Traceurs radioactifs

Résumé

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K⁺) and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Résumé

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K⁺) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH₃/NH₄⁺) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Introduction

L'absorption et la distribution des éléments nutritifs et les substances toxiques influencent fortement la croissance des plantes. En conséquence, l'étude des processus de transport sous-jacents constitue un domaine de recherche important en biologie végétale et en sciences agricoles ^{de 1,2,} en particulier dans les contextes d'optimisation nutritionnelle et les contraintes environnementales (par exemple, le stress salin, la toxicité de l'ammonium). Au premier rang des méthodes de mesure des flux dans les plantes est l'utilisation de traceurs radio-isotopiques, qui a été développé de manière significative dans les années 1950 (voir, par exemple, ³⁾ et continue à être largement utilisé aujourd'hui. D'autres méthodes, telles que la mesure de l'épuisement des nutriments à partir du milieu de la racine et / ou l'accumulation dans les tissus, l'utilisation de micro-électrodes vibrants ions sélectifs tels que MIFE (microélectrode ion estimation du flux) et SIET (balayage de la technique de l'électrode sélective d'ions), et l'utilisation de colorants fluorescents ioniques spécifiques, sont également largement utilisés, mais ils sont limités dans leur capacité à détecter la grippe netxes (c'est à dire, la différence entre les flux et l'efflux). L'utilisation de radio-isotopes, d'autre part, permet au chercheur la capacité unique d'isoler et de quantifier les flux unidirectionnels, qui peut être utilisé pour régler les paramètres cinétiques (par exemple, K _M et V _max), et donner un aperçu de la capacité, énergétique, mécanismes et la régulation, des systèmes de transport. Mesures de flux unidirectionnels à base de radiotraceurs sont particulièrement utiles dans des conditions où le flux dans la direction opposée est élevé, et le chiffre d'affaires de piscines intracellulaires est rapide ^4. En outre, les méthodes radiotraceurs permettent des mesures à effectuer en vertu des concentrations assez élevées de substrat, contrairement à beaucoup d'autres techniques (voir «Discussion», ci-dessous), parce que l'isotope tracé est observé sur un fond d'un autre isotope du même élément.

Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour la mesure radio-isotopique de unidirectionnelle et nET flux de nutriments minéraux et des substances toxiques dans les plantes intactes. L'accent sera mis sur la mesure du flux de potassium (K ^+), un macro plante ^5, et de l'ammoniac / ammonium (NH ₃ / NH ₄ ^+), un autre macronutriments qui est, cependant, toxique lorsqu'il est présent à des concentrations élevées (par exemple, 1 10 mM) ^2. Nous allons utiliser les radio-isotopes ⁴² K ⁺ (t _1/2 = 12,36 h) et ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ⁺ (t _1/2 = 9,98 min), respectivement, pour les plants intacts de l'orge du système de modèle (Hordeum vulgare L .), dans la description des deux principaux protocoles: afflux directe (DI) et analyse parcellaire par traceur efflux (CATE). Il faut noter d'emblée que cet article décrit simplement les étapes nécessaires pour effectuer chaque protocole. Le cas échéant, une brève explication des calculs et la théorie sont fournis, mais détaillées expositions de chaque techniqueLe contexte et la théorie de 'peuvent être trouvés dans plusieurs articles de fond sur le sujet ^4,6-9. Fait important, ces protocoles sont largement transférables au flux analyse d'autres éléments nutritifs / substances toxiques (par exemple, ²⁴ Na ^{+, 22} Na ^{+, 86} Rb ^{+, 13} NO ₃ ^-) et à d'autres espèces de plantes, mais avec quelques mises en garde (voir ci-dessous) . Nous soulignons également l'importance que tous les chercheurs travaillant avec des matières radioactives doivent travailler sous une licence arrangé par ionisants la réglementation de la sécurité de rayonnement de leur institution.

Protocole

1. Plante Culture et préparation

1. Pousser les semis d'orge hydroponique pendant 7 jours dans une chambre de croissance à température contrôlée (pour plus de détails, voir ^10).
   NOTE: Il est important de considérer l'examen des plantes à divers stades de développement, comme les besoins en nutriments vont changer avec l'âge.
2. Un jour avant l'expérimentation, regrouper plusieurs plants ensemble pour faire une seule répétition (3 plants par paquet de DI, 6 plantes par paquet pour CATE). Semis Bundle en enroulant un morceau de tube Tygon 2 cm autour de la partie basale des pousses, et la fixation du tube avec du ruban adhésif pour créer un «collier».
   REMARQUE: Le nombre de plants par faisceau peut varier selon les conditions expérimentales ^10,13,14. Le regroupement est fait pour améliorer les statistiques et la précision de mesure, en particulier lorsque la masse racinaire et / ou une activité spécifique sont faibles.

2 Préparation des solutions expérimentales / Matériaux

contenu "> REMARQUE: Ce qui suit est généralement effectuée un jour avant l'expérimentation.

1. Pour DI, rassemblez les informations suivantes: pré-étiquetage, l'étiquetage et des solutions de désorption (pour plus de détails, voir ^11), tubes de centrifugation (pour l'essorage des échantillons de plantes), et flacons d'échantillon (du matériel végétal et l'activité spécifique [S _o; voir ci-dessous]). Aérer et mélanger toutes les solutions.
2. Pour CATE, recueillir les suivants: solutions, d'étiquetage et d'élution aéré bien mélangé (pour plus de détails, voir ^10), entonnoirs efflux, tubes de centrifugation (pour l'essorage des échantillons de plantes), et flacons d'échantillon (pour éluats, des échantillons de plantes, et détermination de S _o et le facteur de dilution [D _f; voir ci-dessous]).

3 Préparer radiotraceurs

ATTENTION: Les étapes de sécurité suivantes doivent être prises avant de travailler avec la radioactivité.

1. Veiller à ce que les exigences de la radioactive matériaux licence sont comprises et respectées. Porter un équipement de sécurité approprié (c.-à-lunettes, gants, blouse de laboratoire, le plomb gilet / collier) et dosimètres (par exemple, l'anneau de TLD et insigne). Mettre en place de protection (c.-à-plexiglas et briques de plomb) et effectuer des travaux radioactifs derrière elle. Assurez-vous que d'un compteur Geiger-Müller est présent afin de surveiller régulièrement la contamination.
2. Préparation de ⁴² K ⁺
   1. Placez un récipient propre et sec sur la balance. La balance à zéro.
   2. Retirer le flacon de traceur (20 mCi de ⁴² K ₂ CO _3, sous forme de poudre) de l'emballage et versez traceur dans le bécher. Prenez note de la masse.
   3. Pipette 19,93 ml de dH ₂ O, suivi par 0,07 ml de H ₂ SO _4, dans le bécher. Cela conduira à la réaction chimique suivante:
      ⁴² K ₂ CO ₃ (S) + H ₂ SO ₄ (l) + H ₂ O (l) → ⁴² K ₂ SO ₄ (L) + CO ₂ (v) + 2H ₂ O (l)
   4. Calculer la concentration de la solution mère radioactive, compte tenu de la masse et le poids moléculaire de K ₂ CO _3, et le volume (20 ml).
      NOTE: Si vous travaillez avec ¹³ NH ^_3/13 NH ₄ ⁺ Le traceur est produit dans un cyclotron par le bombardement de protons de l'atome d'oxygène de l'eau (qui entraîne généralement 100-200 activité mCi pour des détails de production, voir ^12). Parce que la quantité de NH ^{14 _3/14} NH ₄ ⁺ est extrêmement faible dans ces solutions, la concentration en N de la solution mère est négligeable.

4 Afflux directe (DI) Mesure

1. Pour ⁴² K ^+, pipette la quantité de solution mère radioactif nécessaire pour atteindre la concentration finale souhaitée de K ⁺ dans la solution d'étiquetage.
   1. Pour ¹³ NH _^3/13 NH ₄ ^+, pipette une petite quantité (<0,5 ml) dans la solution d'étiquetage. Laisser la solution d'étiquetage à mélanger soigneusement (par l'intermédiaire d'aération).
2. Introduire à la pipette un sous-échantillon de 1 ml de solution d'étiquetage dans un flacon échantillon et répéter trois fois (4 échantillons au total).
   1. Mesurer la radioactivité dans des flacons (en "coups par minute", cpm), à l'aide d'un compteur gamma. Assurez-vous que le compteur est programmé de telle sorte que les lectures cpm sont corrigées pour la décroissance isotopique (ceci est particulièrement important pour ces traceurs de courte durée).
   2. Calculer S _o (exprimée en cpm mol ^-1) par la moyenne des comptages des quatre échantillons (cpm ml ^-1) et en divisant par la concentration du substrat dans la solution (mol ml ^-1).
3. Plongez dans les racines pré-étiquetage (non radioactif) solution pendant 5 min, d'effectuer une pré-équilibrer les plantes dans des conditions d'essai (voirpar exemple, ^10,13,14 des variations de temps de pré-étiquette).
4. Plongez racines dans l'étiquetage (radioactifs) solution pendant 5 min.
   NOTE: Les temps d'étiquetage peuvent varier en fonction expérience ^3,4,7-10.
5. Transfert des racines de solution de désorption de 5 sec pour éliminer la plus grande partie de la radioactivité adhérant en surface. Transfert des racines dans un deuxième bécher de solution de désorption pendant 5 min à racines plus claires de traceur extracellulaire.
6. Disséquer et pousses séparées, pousses basales, et les racines.
7. Passer racines dans des tubes à centrifuger et des échantillons de rotation pendant 30 s à une faible vitesse, de qualité clinique centrifugeuse (~ 5 000 x g) pour éliminer l'eau interstitielle et superficielle.
8. Peser racines (poids frais, FW).
9. Compter la radioactivité dans des échantillons de plantes (tournage, tournage de base, et la racine; voir l'étape 4.2.1).
10. Calculer le flux. Calculer afflux dans la plante en utilisant la formule
    Φ = Q * / S _o poids _L
    où Φ est le flux(Pmol g ^-1 h ^-1), Q * est la quantité de traceur accumulée dans les tissus (cpm, généralement dans la racine, tirer, et tirer de base, combiné), S _o est l'activité spécifique de la solution de marquage (cpm pmol ^{- 1),} w est le poids frais des racines (g), et _L t est le temps d'étiquetage (h).
    REMARQUE: calcul plus sophistiqué peut être faite pour tenir compte simultanée traceur efflux de racines pendant l'étiquetage et la désorption, en fonction des paramètres obtenus à partir de CATE (voir ci-dessous pour des détails, voir ^4).

5. parcellaire Analyse par Tracer efflux (CATE) Mesure

1. Préparer une solution d'étiquetage et mesure S _o (voir les étapes 04.01 à 04.02, ci-dessus).
2. Mesurer le facteur de dilution (D _f).
   REMARQUE: Souvent, la position de l'échantillon par rapport au détecteur dans le compteur gamma peut influencer la quantitéde rayonnement mesuré. Voir discussion pour plus de détails.
   1. Après la mesure de S _o, ajouter 19 ml de H ₂ O pour chaque échantillon (tel que le volume final = volume d'éluat = 20 ml). Nombre de radioactivité dans chaque échantillon de 20 ml (voir l'étape 4.2.1).
   2. Calculer D _f en divisant les cpm moyenne des échantillons de 1 ml par le cpm moyenne des échantillons de 20 ml.
3. Plongez racines dans une solution d'étiquetage pendant 1 heure.
4. Retirez les plantes de solutions d'étiquetage et de transfert des plantes à efflux entonnoir, tout en s'assurant que le système racinaire est dans l'entonnoir. Doucement plantes sécurisés à côté de l'efflux entonnoir en appliquant une petite bande de ruban adhésif sur le collier en plastique.
5. Verser doucement le premier éluat dans l'entonnoir. Lancement d'une temporisation (comptage).
6. Ouvrez le robinet et recueillir l'éluat dans le flacon d'échantillon après 15 secondes (note: le temps d'élution varie; voir ci-dessous). Fermez le robinet. Verser délicatement la prochaine éluat dans l'entonnoir.
7. REPEAt étape 5.6 pour le reste de la série d'élution, qui suit, de la première à l'éluat final: 15 sec (quatre fois), 20 s (trois fois), 30 sec (deux fois), 40 s (une fois), 50 sec (une fois), 1 min (25 fois), pour une période d'élution total de 29,5 min
   REMARQUE: série de désorption peut varier en fonction des conditions expérimentales ^7-10,13,14.
8. Une fois que le protocole d'élution est terminée, les plantes de la récolte (étapes 4.6 à 4.8 ci-dessus).
9. Compter de la radioactivité dans les éluats et des échantillons de plantes dans le compteur gamma (multipliant la lecture pour chaque éluat par D _f, voir 5.2).
10. Terrain de presse de traceur (cpm g (FW racine) ^-1 min ^-1) en fonction du temps d'élution. Pour l'état d'équilibre, effectuer des régressions linéaires et des calculs de flux, la demi-vie de change, et les tailles de la piscine (pour plus de détails, voir ^6-9).

Résultats

La figure 1 montre les isothermes trouvés en utilisant la technique de DI (à ¹³ N), pour l'arrivée de NH ₃ dans les racines de plants d'orge intactes cultivées à élevée (10 mM), NH ₄ ^+, et soit faible (0,02 mM) ou élevée (5 mM ) K ^+. Les isothermes montrent une cinétique de Michaelis-Menten NH ₃ lorsque les flux sont tracés en fonction de la concentration externe NH ₃ ([NH _{3] de poste;} ajustés par...

Discussion

Comme le montrent les exemples ci-dessus, la méthode de traceur radioactif est un puissant moyen de mesurer les flux unidirectionnels de nutriments et de substances toxiques in planta. Figure 1 montre que le NH ₃ afflux peut atteindre plus de 225 pmol g ^-1 h ^-1, ce qui est peut-être le plus de bonne foi flux transmembranaire jamais enregistré dans un système de centrale ^13, mais l'ampleur de ce flux ne serait pas visible si seulement ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gamma counter	Perkin Elmer		Model: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counter	Ludlum Measurements Inc.		Model 3 survey meter
400 ml glass beakers	VWR	89000-206	For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnel	VWR	89000-466	For efflux funnel
Large tubing	VWR	529297	For efflux funnel
Medium tubing	VWR	684783	For bundling
Small tubing	VWR	63013-541	For aeration
Aeration manifold	Penn Plax Air Tech	vat 5.5	To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vials	VWR	66022-128	For gamma counting
Glass centrifuge tubes	VWR	47729-576	For spin-drying root samples
Kimwipes	VWR	470173-504	For spin-drying root samples
Dissecting scissors	VWR	470001-828
Forceps	VWR	470005-496
Low-speed clinical centrifuge	International Equipment Co.	76466M-4	For spin-drying root samples
1 ml pipette	Gilson	F144493
10 ml pipette	Gilson	F144494
1 ml pipette tips	VWR	89079-470
10 ml pipette tips	VWR	89087-532
Analytical balance	Mettler toledo	PB403-S/FACT