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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Abstract

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Introduzione

L'assorbimento e la distribuzione di nutrienti e sostanze tossiche influenzano fortemente la crescita delle piante. Di conseguenza, l'indagine dei processi di trasporto sottostanti costituisce un'importante area di ricerca in biologia vegetale e scienze agrarie 1,2, soprattutto nei contesti di ottimizzazione nutrizionale e stress ambientali (ad esempio, stress salino, la tossicità di ammonio). Primo fra i metodi per la misurazione dei flussi nelle piante è l'uso di traccianti radioisotopici, che è stato sviluppato in modo significativo nel 1950 (si veda ad esempio, 3) e continua ad essere ampiamente usato oggi. Altri metodi, come la misurazione di esaurimento degli elementi nutritivi dal mezzo di root e / o l'accumulo nei tessuti, l'uso di microelettrodi vibranti ione-selettivi, come MIFE (microelettrodo ion stima di flusso) e SIET (scansione tecnica elettrodo ione-selettivo), e l'uso di coloranti fluorescenti ione-selettivo, sono anche ampiamente applicati, ma sono limitati nella loro capacità di rilevare l'influenza nettassi (cioè, la differenza tra afflusso e l'efflusso). L'uso di radioisotopi, dall'altro, consente al ricercatore la capacità unica di isolare e quantificare flussi unidirezionali, che può essere utilizzato per risolvere parametri cinetici (ad esempio, K M e V max), e fornire una conoscenza della capacità, energetica, meccanismi e regolazione, dei sistemi di trasporto. Misure di flusso unidirezionali realizzati con radiotraccianti sono particolarmente utili in condizioni in cui il flusso nella direzione opposta è alto, e il fatturato delle piscine intracellulari è rapida 4. Inoltre, i metodi radiotracciante consentono misurazioni condotte sotto concentrazioni piuttosto elevate di substrato, a differenza di molte altre tecniche (vedi 'Discussione', qui di seguito), perché l'isotopo tracciato si osserva su uno sfondo di un altro isotopo dello stesso elemento.

Qui, forniamo la procedura dettagliata per la misurazione di radioisotopi unidirezionale e net flussi di nutrienti minerali e di sostanze tossiche nelle piante intatte. L'accento verrà effettuato sulla misurazione del flusso di potassio (K +), un impianto di macronutrienti 5, e ammoniaca / ammonio (NH 3 / NH 4 +), un'altra macronutrienti che è, tuttavia, tossici se presenti a concentrazioni elevate (ad esempio, 1- 10 mM) 2. Useremo i radioisotopi 42 K + (t mezzo = 12.36 ore) e 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), rispettivamente in piantine intatte del orzo sistema modello (Hordeum vulgare L .), nella descrizione dei due protocolli principali: afflusso diretta (DI) e l'analisi compartimentale da tracciante efflusso (CATE). Dobbiamo notare fin dall'inizio che questo articolo descrive semplicemente i passaggi necessari per eseguire ogni protocollo da. Se del caso, brevi spiegazioni dei calcoli e la teoria sono forniti, ma dettagliate esposizioni di ogni tecnica'S sfondo e la teoria si possono trovare in diversi articoli importanti sull'argomento 4,6-9. È importante sottolineare che questi protocolli sono ampiamente trasferibili ad flux analisi di altri nutrienti / sostanze tossiche (ad esempio, 24 Na +, 22 Na +, Rb + 86, 13 NO 3 -) e di altre specie di piante, anche se con qualche distinguo (vedi sotto) . Sottolineiamo inoltre l'importanza che tutti i ricercatori che lavorano con materiali radioattivi devono lavorare sotto una licenza organizzato tramite ionizzanti regolatore di sicurezza di radiazione della loro istituzione.

Protocollo

1. coltura delle piante e preparazione

  1. Crescere piante di orzo idroponica per 7 giorni in una camera di crescita a clima controllato (per i dettagli, vedi 10).
    NOTA: E 'importante considerare l'esame di piante in una varietà di fasi di sviluppo, come esigenze nutrizionali cambiano con l'età.
  2. Un giorno prima della sperimentazione, raggruppare diverse piantine insieme per fare una singola replica (3 piante per pacco per DI, 6 piante per pacco per CATE). Piantine Bundle avvolgendo un 2-cm pezzo di tubo Tygon attorno alla porzione basale dei germogli, e assicurare il tubo con del nastro adesivo per creare un "collare".
    NOTA: Il numero di piante per pacco può variare in base alle condizioni sperimentali 10,13,14. Bundle viene fatto per migliorare le statistiche e precisione di misura, in particolare quando la massa radicale e / o attività specifica sono bassi.

2 Preparazione di Sperimentali Soluzioni / Materiali

contenuti "> NOTA: La seguente è in genere eseguita 1 giorno prima sperimentazione.

  1. Per la DI, raccogliere le seguenti: Pre-etichettatura, etichettatura e soluzioni di desorbimento (per i dettagli, vedi 11), tubi di centrifugazione (per spin-essiccazione di campioni vegetali), e vial di campioni (per materiale vegetale e l'attività specifica [S o; vedi sotto]). Aerare e mescolare tutte le soluzioni.
  2. Per CATE, raccogliere le seguenti: soluzioni ben mescolato, etichettatura aerata e di eluizione (per i dettagli, vedi 10), imbuti, tubi di efflusso centrifugazione (per spin-essiccazione di campioni vegetali), e fiale di campioni (per eluati, campioni vegetali, e determinazione di S o fattore di diluizione e [D f; vedere sotto]).

3 Preparare radiotracciante

ATTENZIONE: Le seguenti operazioni di sicurezza dovrebbero essere prese prima di lavorare con la radioattività.

  1. Assicurarsi che i requisiti del radioactiva licenza materiali sono compresi e seguiti. Indossare un equipaggiamento di sicurezza (ad esempio, occhiali, guanti, camice da laboratorio, piombo maglia / collare) e dosimetri (ad esempio, l'anello TLD e distintivo). Impostazione di schermatura (cioè, plexiglas e mattoni di piombo) e svolgere un lavoro radioattivo dietro. Assicurarsi che un contatore Geiger-Müller è presente al fine di monitorare regolarmente per contaminazione.
  2. Preparazione di 42 K +
    1. Porre un bicchiere pulito e asciutto sulla bilancia. Azzerare la bilancia.
    2. Rimuovere fiala di tracciante (20 mCi di 42 K 2 CO 3, in forma di polvere) dalla confezione e versare tracciante nel becher. Prendere nota della massa.
    3. Pipettare 19.93 ml di dH 2 O, seguita da 0,07 ml di H 2 SO 4, nel bicchiere. Questo guiderà la seguente reazione chimica:
      42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H 2 O (l) → 42 K 2 SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l)
    4. Calcolare la concentrazione della soluzione madre radioattivi, data la massa e il peso molecolare di K 2 CO 3, e il volume (20 ml).
      NOTA: Se si lavora con 13 NH 3/13 NH 4 + Il tracciante è prodotto in un ciclotrone mediante il bombardamento protone dell'atomo di ossigeno di acqua (tipicamente conseguente 100-200 mCi di attività, per dettagli di produzione, vedere 12). Poiché la quantità di 14 NH 3/14 NH 4 + è estremamente bassa in queste soluzioni, la concentrazione N della soluzione madre è trascurabile.

4 Afflusso diretta (DI) di misura

  1. Per 42 K +, pipettare quantità di soluzione madre radioattivo necessario per raggiungere la concentrazione finale desiderata di K + nella soluzione di etichettatura.
    1. Per 13 NH 3/13 NH 4 +, pipetta una piccola quantità (<0,5 ml) nella soluzione di etichettatura. Lasciare che la soluzione di etichettatura a mescolare bene (con aerazione).
  2. Pipettare un sotto-campione di 1 ml di soluzione di etichettatura in una provetta e ripetere tre volte (4 campioni in totale).
    1. Misurare la radioattività in flaconcini (in "conteggi per minuto", CPM), utilizzando un contatore gamma. Verificare che il contatore è programmato in modo tale che le letture CPM sono corretti per il decadimento isotopico (questo è particolarmente importante per tali traccianti di breve durata).
    2. Calcola S o (espressa come cpm mol -1), facendo la media dei conteggi dei quattro campioni (CPM ml -1) e dividendo per la concentrazione di substrato in soluzione (mmol ml -1).
  3. Immergere le radici in pre-etichettatura soluzione (non radioattivo) per 5 minuti, a pre-equilibrare le piante in condizioni di prova (vediad esempio, 10,13,14 per variazioni nel tempo di pre-label).
  4. Immergere radici nella soluzione di etichettatura (radioattiva) per 5 min.
    NOTA: i tempi di etichettatura possono variare in base esperimento 3,4,7-10.
  5. Trasferire le radici di soluzione desorbimento per 5 secondi per rimuovere la maggior parte della radioattività-aderente di superficie. Trasferire le radici in un secondo bicchiere di soluzione di desorbimento per 5 minuti a ulteriori chiare radici del tracciante extracellulare.
  6. Sezionare e germogli separati, germogli basali e radici.
  7. Mettere radici in provette da centrifuga e campioni di spin per 30 secondi in un a bassa velocità, clinico-grade centrifuga (~ 5.000 xg) per rimuovere la superficie e l'acqua interstiziale.
  8. Pesare radici (peso fresco, FW).
  9. Contare la radioattività in campioni di piante (sparare, sparare basale, e la radice; vedere il punto 4.2.1).
  10. Calcolare il flusso. Calcolare afflusso nella pianta utilizzando la formula
    Φ = Q * / S o WT L
    dove Φ è il flusso(G mol -1 h -1), Q * è la quantità di tracciante accumulata nei tessuti (cpm, di solito in radice, sparare e sparare basale, combinato), S o è l'attività specifica della soluzione di etichettatura (cpm micromol - 1), w è il peso fresco radice (g), e L t è il tempo di etichettatura (hr).
    NOTA: il calcolo più sofisticato può essere fatto per tenere conto di simultanea tracciante efflusso dalle radici durante l'etichettatura e desorbimento, in base ai parametri ottenuti da CATE (vedi sotto, per maggiori dettagli, vedi 4).

5. Compartimentale Analisi per Tracer Efflux (CATE) Misurazione

  1. Preparare la soluzione di etichettatura e misura S o (vedere i punti 4,1-4,2, sopra).
  2. Misura fattore di diluizione (D f).
    NOTA: Spesso, la posizione del campione rispetto al rivelatore nel contatore gamma può influenzare la quantitàdi radiazione misurata. Vedi di discussione per i dettagli.
    1. Dopo aver misurato S o, aggiungere 19 ml di H 2 O per ogni campione (tale che il volume finale = volume eluito = 20 ml). Conteggio della radioattività in ogni campione da 20 ml (vedere il punto 4.2.1).
    2. Calcolare D f dividendo il cpm medio dei campioni 1 ml dalla cpm media dei campioni di 20 ml.
  3. Immergere radici nella soluzione di etichettatura per 1 ora.
  4. Rimuovere le piante da soluzione di etichettatura e di trasferimento piante per efflusso imbuto, assicurando tutto il materiale principale è dentro l'imbuto. Delicatamente piante protetta a lato della efflusso imbuto applicando una piccola striscia di nastro adesivo sopra il collare di plastica.
  5. Versare delicatamente il primo eluato nell'imbuto. Avviare il timer (contando verso l'alto).
  6. Aprire il rubinetto e raccogliere l'eluato nel flaconcino campione dopo 15 sec (nota: tempo di eluizione può variare, vedi sotto). Chiudere il rubinetto. Versare delicatamente il prossimo eluato nell'imbuto.
  7. Ripett passo 5.6 per il resto della serie eluizione, che segue, dal primo al eluato finale: 15 sec (quattro volte), 20 sec (tre volte), 30 sec (due volte), 40 sec (una volta), 50 sec (una volta), 1 min (25 volte), per un periodo di eluizione totale di 29,5 min
    NOTA: serie desorbimento può variare in base alle condizioni sperimentali 7-10,13,14.
  8. Una volta che il protocollo eluizione è completo, piante raccolta (passi 4,6-4,8, sopra).
  9. Contare la radioattività in eluati e campioni vegetali in gamma counter (moltiplicando la lettura per ciascun eluato da D f, vedi 5.2).
  10. Rilascio della trama tracciante (cpm g (radice FW) -1 min -1) in funzione del tempo di eluizione. Per le condizioni di stato stazionario, eseguire regressioni lineari e calcoli di flussi, emivite di scambio, e le dimensioni della piscina (per i dettagli, vedere 6-9).

Risultati

La figura 1 mostra isoterme trovati con la tecnica DI (con 13 N), per l'afflusso di NH 3 in radici di piante di orzo coltivate intatte ad alta (10 mm) NH 4 +, e sia bassa (0,02 mm) o alto (5 mM ) K +. Le isoterme mostrano cinetica di Michaelis-Menten quando NH 3 flussi sono riportati in grafico in funzione della concentrazione esterna NH 3 ([NH 3] ext; rettificato dalla variazione del pH della soluzione 13)....

Discussione

Come dimostrato negli esempi precedenti, il metodo radiofarmaco è un potente mezzo di misurare flussi unidirezionali di nutrienti e sostanze tossiche in planta. Figura 1 mostra che NH 3 afflusso può raggiungere superiore a 225 micromol g -1 h -1, che è forse la più alto bona fide flusso transmembrana mai riportato in un sistema impiantistico 13, ma la grandezza di questo flusso non sarebbe visibile se sono stati misurati solo i flussi net...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Gamma counterPerkin ElmerModel: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counterLudlum Measurements Inc.Model 3 survey meter
400 ml glass beakersVWR89000-206For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnelVWR89000-466For efflux funnel
Large tubingVWR529297For efflux funnel
Medium tubingVWR684783For bundling
Small tubingVWR63013-541For aeration
Aeration manifoldPenn Plax Air Techvat 5.5To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vialsVWR66022-128For gamma counting
Glass centrifuge tubesVWR47729-576For spin-drying root samples
KimwipesVWR470173-504For spin-drying root samples
Dissecting scissorsVWR470001-828
ForcepsVWR470005-496
Low-speed clinical centrifugeInternational Equipment Co.76466M-4For spin-drying root samples
1 ml pipetteGilsonF144493
10 ml pipetteGilsonF144494
1 ml pipette tipsVWR89079-470
10 ml pipette tipsVWR89087-532
Analytical balanceMettler toledoPB403-S/FACT

Riferimenti

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