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摘要

DNA和蛋白质序列特异性标记的亲和力，或使用DNA或蛋白质的甲基和合成的辅助因子的类似物的荧光报告基团。取决于酶，氮丙啶或双活化的辅助因子类似物的辅因子特异性的用于一个或两个步骤的标签。

摘要

S -Adenosyl -1-甲硫氨酸（的AdoMet或SAM）依赖性甲基转移（转移酶）催化激活甲基来自的AdoMet中的DNA，RNA，蛋白质和小生物分子转移到特定的位置。这种自然甲基化反应可扩展到各种各样的使用合成的辅助因子的类似物的烷基化反应。更换的AdoMet的反应性锍中心与氮丙啶环的导致辅因子可加上由各种DNA MTases的DNA。这些氮丙啶辅助因子可配记者团在腺嘌呤部分的不同位置，并用于ethyltransferase- EP3受体激动剂诱导DNA（笑DNA） 的 L-阿贝尔ING S equence 专用的M。作为一个典型的例子，我们给出一个协议的pBR322的质粒DNA的生物素化在5'- ATCG T-3'序列与该DNA转移酶M.BseCI和氮丙啶辅因子6BAz在一个步骤。延长活化甲基与不饱和烷基结果另一类的AdoMet类似物的是用以米 ethyltransferase定向T的一个ctivatedģroups（MTAG）转让（BOT）的。由于延长侧链由锍中心和不饱和键激活时，这些辅因子被称为双活化的AdoMet类似物。这些类似物不仅用作辅因子用于DNA MTases，如氮丙啶辅因子，而且还用于RNA，蛋白质和小分子MTases。它们通常用于转移酶底物与在第二化学步骤标记报告基团独特的官能团的酶促修饰。这被例示在一个协议组蛋白H3蛋白质的荧光标记。一个小炔基是从辅因子类似物SeAdoYn由组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）转移酶SET7 / 9随后的单击标签转移到蛋白质炔基化组蛋白H3与TAMRA叠氮化物。与辅酶类似物转移酶介导的标签是一个有利的技术，许多令人兴奋的应用，包括识别和功能研究转移酶底物，以及DNA基因分型和甲基化检测。

引言

核酸1,2和蛋白质3,4特定的标签是功能性表征，医学诊断和（纳米）生物技术重大利益的。在这里，我们对这些生物聚合物是基于 S -adenosyl -1-甲硫氨酸（的AdoMet或SAM）依赖性甲基转移（MTases）提出了一种酶标记方法。这类酶（EC 2.1.1。）的目标的核酸和蛋白质的特定残基中的各个位置上的亲核（氮，氧，硫和碳原子）和自然传输的辅助因子的AdoMet（ 图1A）5的活化的甲基。此外，MTases可以利用合成的辅助因子的类似物与亲和标记，荧光团或其它标签（ 图1B）6特异性标记。已经开发了两个班的AdoMet类似物:氮丙啶辅助因子局长 equence 专用的M ethyltransferase- 我 EP3受体激动剂诱导L阿贝尔荷兰国际集团 （笑）7和双启动的AdoMet类似物对M ethyltransferase定向T的一个 ctivated 摹 roups转让（BOT）（MTAG）8。

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图1:反应由甲基转移（MTases）从天然辅因子的AdoMet（SAM）的各种基材，包括DNA，RNA，蛋白质和小生物分子A.甲基转移的核酸和蛋白质B.标识/官能（NNNNN = 催化。碱基对的DNA，核苷酸的RNA和氨基酸的蛋白质; XXXXX =识别与绿色目标残渣），与​​合成辅酶类似物转移酶的序列。含记者组氮丙啶辅助因子（蓝色球）附着到腺嘌呤环是序列与靶残基（左）和双 - 活化的AdoMet类似物具体地说耦合导致传送携带化学记者Y（右），它可以通过在第二步骤中生物正交点击反应进行标记扩展烷基链。 请点击此处查看该图的放大版本。

氮丙啶辅助因子与DNA MTases效果最好。它们含有与氮原子9（或N -mustard 10,11）代替锍中心作为反应性基团的3元环。该氮原子的质子化激活的氮丙啶环用于由靶核苷酸从而导致共价全辅因子与DNA的偶联亲核攻击。通过将报告基团到腺嘌呤环的氮丙啶的辅助因子，可以组合使用与DNA MTases以在一个步骤中标记的DNA（ 克>图1B，左图）7,12。这表现了详细的DNA与6BAz 13的生物素- 15（氮丙啶辅助因子与生物素附着于腺嘌呤环的6位）和腺嘌呤特异性DNA转移酶来自嗜热脂肪芽孢杆菌 （M.BseCI）16（ 图2，见协议第2节: 通过氮丙啶辅助因子DNA的一步标签）。除了​​M.BseCI（5'-ATCG T-3'识别序列）的DNA MTases从水生栖热菌 （M.TaqI，5'-TCG -3"），从嗜血heamolyticus（M.HhaI，5 '-GÇGC-3'）和从螺原体 （M.SssI，5'- C G-3'）已被成功地用于生物素化的DNA与6BAz 17。此外，氮丙啶辅因子可用于一步法荧光DNA标记18,19。

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图2:DNA与M.BseCI和6BAz序列特异性一步法生物素化的DNA转移酶M.BseCI识别双链DNA序列5'-ATCG T-3'和自然甲基化的第二腺嘌呤的氨基残渣（绿色）使用的AdoMet。随着氮丙啶辅6BAz的反应过程被改变，M.BseCI导致通过耦合整个辅助因子包括生物素（蓝色）与目标腺嘌呤测序特异的DNA生物素化。 请点击此处查看该图的放大版本。

双活化的AdoMet类似物包含扩展的不饱和侧链而不是在锍中心甲基（ 图1B 的吧）20。不饱和双键或三键的β位置到锍中心电子补偿由共轭稳定化中的过渡状态不利位阻效应。因为两者的锍中心和不饱和键激活侧链酶促转移，这些辅因子被命名为双活化的AdoMet类似物。通常情况下，它们被用来在第二步骤8,21传送侧链具有独特的化学基团（化学记者），象氨基，炔和叠氮基团，化学-选择性标记。在一般情况下，双启动的AdoMet类似物不仅可以用作辅助因子DNA MTases 8,20,21也为RNA MTases 22,23和蛋白质MTases 24 - 28，允许RNA和蛋白质的额外的标签。然而，在扩展侧链立体比甲基更苛刻的和扩大的转移酶的活性位点由蛋白质工程是经常连接需要获得有效的传输速率。另一个解决这个问题的方法是使用一个的AdoMet类似物具有小炔基（3个碳原子），其中所述末端炔提供两个功能:酶促转移期间1.稳定过渡态和2反应手柄以下由铜化学修饰催化叠氮炔环加成（CuAAC）点击化学。原来，产生的丙炔的AdoMet模拟29只在有限的使用中性或弱碱性条件下，相当不稳定。这个缺点可以固定通过用硒代替硫原子。所得的辅助因子的5' - [（Se）的[（3 S）-3-氨基-3-羧基丙基〕丙-2- ynylselenonio〕-5'-脱氧腺苷（SeAdoYn， 图3）由野生型DNA的接受，核糖核酸和蛋白质MTases 30 - 32，其废除在许多情况下，需要进行蛋白质工程。这是通过荧光亲例举蛋白标记的组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）转移酶SET7 / 9 33（ 图3，看到协议部3: 通过双活化的辅助因子的两步蛋白标记）。

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图3:序列特异性的两步荧光组蛋白H3与SET7 / 9的标签，SeAdoYn和TAMRA叠氮化物的蛋白质转移酶SET7 / 9自然甲基化使用的AdoMet的氨基中的组蛋白H3的赖氨酸4的（H3K4，绿色）。与双活化的辅助因子SeAdoYn的转移酶转移一个小炔基（红色）与赖氨酸残基。所附终端三键，然后有选择地修改在生物正交点击反应（铜 - 催化的叠氮化物 - 炔环加成，CuAAC）与叠氮化物衍生化TAMRA（四甲基，蓝）的荧光团。加载/ 52014 / 52014fig3highres.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

研究方案

1.一般说明

  1. 商店氮丙啶辅因子6BAz（在DMSO中）和蛋白质转移酶SET7 / 9在-80℃，所有其他试剂包括双活化的辅助因子SeAdoYn和DNA转移酶M.BseCI（在50％甘油）在-20℃下。
  2. 使用消光系数ε269nm（6BAz）=16000厘米-1 M -1和ε260nm处 （SeAdoYn）=15400厘米-1 M -1，在去离子水通过紫外/可见光谱确定6BAz和SeAdoYn的浓度。通过Bradford测定法在280nm确定MTases的浓度，或者，如果消光系数是可用的， 通过直接吸收。
  3. 尽量避免产生气泡密集移液器或涡流，以防止酶失去活性。相反，轻轻吹打上下混合。
  4. 当从储备溶液的DMSO加入氮丙啶辅因子确保测定中的终DMSO浓度为少超过5％。总是包含在试验缓冲液，以防止非特异性反应用DNA的10mM镁离子。
  5. 当从酸性储备溶液添加双活化的辅助因子使用小体积（高度浓缩的储备溶液），以避免pH值的变化，并确保所述测定溶液的pH值不显著变化。避免硫醇， 例如 ，β巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），在测定缓冲液中，因为它们可以用通过所需要的铜离子络合点击干扰反应。

DNA 通过氮丙啶辅因子2.一步法标签

  1. 序列特异性甲基转移酶诱导标签ING（笑）质粒DNA与DNA M.BseCI和转移酶的辅助因子氮丙啶的6BAz。
    1. 解冻，在20℃的辅因子溶液中，制备反应混合物在冰上。
    2. 除了测定执行"辅因子"控制，以可视化的任何非特定的修改，以及一个＆＃8220;酶"的控制，以确保在转移酶制剂是不含天然辅因子的AdoMet的。
    3. 用于测定混合物2微升10×修饰缓冲液（含有100mM的Tris-HCl，100mM的MgCl 2的，20毫β巯基乙醇，pH为7.4），2微升的pBR322（0.5微克/微升），10当量的。 M.BseCI每对DNA识别序列（在pBR322中1识别序列）和氮丙啶辅因子6BAz为60微米的最终浓度为20微升的总体积内。添加辅助因子与DNA转移酶最后。
      注:β巯基乙醇是有毒的，腐蚀性，破坏环境。
    4. 对于"辅"控制加去离子水，而不是M.BseCI并为"酶"控件添加的，而不是6BAz去离子水。
    5. 轻轻吹打上下混合溶液。
    6. 孵育管在55℃下1小时。
    7. 短暂离心以收集所有的液体在管的底部。
  2. 限制修饰测定以验证DNA修饰。
    1. 通过混合10微升10×R.TaqI缓冲液（含有100mM的Tris-HCl，50mM的氯化镁 ，1M氯化钠，1毫克/毫升牛血清白蛋白，pH 8.0）中，80微升去离子水和3.3微升的制备溶液限制性内切酶（REase）从水生栖热菌 （R.TaqI，10U /微升）。确保添加了REase中的最后一步。
    2. 从2.1.7每管加入2微升的10×R。TaqI位缓冲液和28微升溶液从上方（2.2.1）。
    3. 轻轻吹打上下混合溶液。
    4. 孵育管在65℃下进行30分钟。
    5. 短暂离心以收集所有的液体在管的底部。
  3. 有链霉亲和电动汽车变动分析（EMSA）来验证功能修改。
    1. 从各管（2.2.5）中取出25微升，加入2.4微升的链霉亲和解决方案（1毫米相对于链霉米onomer在含有100mM的Na 2 HPO 4的链霉缓冲液，100 mM氯化钠，pH值7.5; 4现金等价物共计生物素）。加入2.4微升链霉缓冲到剩余管中。
    2. 孵育所有试管在37℃下1小时。
  4. 通过琼脂糖凝胶电泳分析。
    1. 添加5微升的6×加样缓冲液（0.25％溴酚蓝，30％甘油）到每个管中。
    2. 轻轻的混合解决方案。
    3. 负载10微升各样品进琼脂糖凝胶（1％琼脂糖在0.5×TBE缓冲液含有1x GelRed从10000原液）的孔中。
    4. 运行在0.5X TBE缓冲凝胶具有80 V约。 1小时。
    5. 可视化上的UV表（312纳米）用CCD照相机装有一个过滤器（540±50毫微米）的DNA条带。
      注:UV光损害眼睛和皮肤。

通过双激活辅因子3.两步蛋白标记

  1. Methyltransf擦除导演的活化基团（MTAG）与SET7 / 9和双激活辅SeAdoYn转移的组蛋白H3赖氨酸4标记（改性工序）。
    1. 解冻的组件，并准备将反应混合物在冰上。注意:始终保持SeAdoYn冷却，以免恶化。
    2. 除了测定执行"辅因子"控制，以可视化的任何非特定的修改，以及一个"酶"的控制，以排除荧光探针的非特异性反应。
    3. 制备含有改性缓冲液（50mM的Tris-HCl，5％甘油，pH值8.5），10μM组蛋白H3，10μMSET7 / 9和600μMSeAdoYn（在硒两个差向异构体的混合物）的测定溶液（20微升）。在过去的步骤添加辅酶，然后转移酶。
    4. 对于"辅"控制准备检测解决方案的3.1.3，并添加60毫米的AdoMet的合成辅酶竞争。对于"酶"控件添加的，而不是SeAdoYn去离子水。
    5. 通过慢慢地上下吹打混匀的解决方案。加入1微升每个解决方案，以pH值带（ - 10 pH范围5）的上现场检查pH值。
    6. 孵育在37℃下2小时。
    7. 与此同时制备一个12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶（凝胶运行:357毫的Bis-Tris pH值6.5-6.8，0.1％（重量/体积）的APS，0.04％（体积/体积）TEMED和12％丙烯酰胺/双丙烯酰胺37.5:1 ;装载凝胶:357毫的Bis-Tris pH值6.5-6.8，0.1％（重量/体积）的APS，0.04％（体积/体积）TEMED和5％丙烯酰胺/双丙烯酰胺37.5:1）。
      注:丙烯酰胺/双丙烯酰胺是有毒的，有害健康。在此过程中，应戴上手套。
  2. alkinylated赖氨酸4的通过铜催化的叠氮化物-炔环加成（CuAAC）（标记步骤）化学标记中组蛋白H3。
    1. 只是改性反应结束之前制备含有3mM的硫酸铜 ，3毫三（3-羟基丙基三唑基甲基）胺（THPTA），250毫抗坏血酸钠和6毫TAMRA叠氮化物用5倍点击混合的20微升总体积。
    2. 加入5微升新鲜制备的5×点击混合到每个管中以启动CuAAC和骤冷的改性反应。
    3. 吹打向上和向下轻轻混匀。
    4. 保护用铝箔所有管从光，以避免光致漂白的荧光团。
    5. 孵育在20℃进行1小时。
  3. 蛋白质沉淀，以除去过量的游离TAMRA荧光团。
    1. 34 -为了避免荧光标记的组蛋白H3通过密集的凝胶荧光自由TAMRA荧光的风头甚至盖过，由蛋白质（3.3.4 3.3.2）的沉淀去除多余的荧光。
    2. 添加75微升甲醇，18.8微升氯仿和50微升每次加入后短暂的去离子水，以每管并涡旋。离心在16000×g离心5分钟。除去上层相，而不会干扰所述界面层，其中包含的蛋白质。
    3. 添加56.3微升甲醇剩余期n各自管中，涡旋并离心在16000×g离心5分钟以沉淀蛋白质。去除上清。重复此步骤，洗涤沉淀。
    4. 覆盖开放管与无尘组织，让他们干15 - 30分钟。
  4. 通过 SDS-PAGE分析。
    1. 溶解从3.3.4所述沉淀的蛋白质在20μlSDS上样缓冲液（50mM的Tris-HCl，2.5％（重量/体积）SDS，10％（体积/体积）甘油，320毫β巯基乙醇和0.05％（重量/ ⅴ）溴酚蓝，pH6.8）中。一定要通过冲洗管的壁用吸管完全溶解沉淀。
    2. 孵育样品在95℃下进行10分钟，并让它们向下冷却到20℃。
    3. 短暂离心以收集所有的液体在管的底部。
    4. 加载每个样品的总量成SDS聚丙烯酰胺凝胶（3.1.7）的孔中。使用的50mM MOPS，50毫摩尔Tris-X（Tris碱），5毫摩尔EDTA，0.1％（重量/体积）SDS作为电泳缓冲液电泳。
    5. 运行与120 V凝胶约。 90分钟。
    6. 可视化在凝胶上荧光的UV表（312纳米）用CCD照相机装有一个过滤器（540毫微米±50纳米）。
      注:UV光损害眼睛和皮肤。

结果

DNA通过氮丙啶辅因子一步法标签

本实施例中进行反应用DNA转移酶M.BseCI，该修改的双链5'- ATCG T-3'序列中的第二个腺嘌呤残基和具有一个识别位点上的pBR322的质粒（ 图4A）。为了测试质粒标签，pBR322中是用限制性内切酶（REase）R.TaqI（5'-TCGA-3'）的挑战。 R.TaqI具有七个位点上的pBR322，其中之一包括在M.BseCI站点。如果出现标签，所述M.Bs...

讨论

DNA与DNA MTases和氮丙啶辅助因子（笑DNA）中的一个步骤的标签是一个强大的方法，但计划实验时，有些方面应该考虑。

氮丙啶辅:用于DNA标记的6BAz浓度M.BseCI为60微米。当使用其它DNA MTases辅因子浓度应被优化， 例如 ，浓度低至20μM的已使用用该DNA转移酶M.TaqI 19。低6BAz浓度具有四倍过量的链霉（结合位点相对于生物素在测定的总量）的能够孵育REase后直接?...

披露声明

The authors disclose the following competing financial interest: E.W. is inventor on related patents.

致谢

The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
6BAzSynthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012.
β-MercaptoethanolServa28625
Acetic acidFisher Scientific10304980
Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1Serva10688
UltraPure AgaroseInvitrogen16500100
Ammonium persulfate (APS)Serva13375
Bis-TrisGerbu1304
Boric acidGerbu1115
Bromophenol blue Na saltServa15375
Copper(II) sulfateAldrichC1297
ChloroformFisher Scientific10020090
Coomassie Brilliant BlueServa17525
EDTA disodium saltGerbu1034
EthanolMerck100983
GelRed (10,000x in water)Biotium41003
Glycerol (99.5%)Gerbu2006
FastRuler Low Range DNA LadderThermo ScientificSM1103
Histone H3Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
M.BseCIExpression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
MethanolFisher Scientific10675112
Magnesiumchloride  hexahydrateJ.T. Baker4003
MOPSGerbu1081
Sodium chlorideGerbu1112
pH strip (Neutralit)Merck1,095,330,001
pBR322Thermo ScientificSD0041
R.TaqI (10 u/µl)Thermo ScientificER0671
SeAdoYnSynthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
StreptavidinGerbu3058
(+)-Sodium L-ascorbateSigma Life ScienceA7631
SDS GranularGerbu1833
di-Sodium hydrogenphosphateMerck106,586
TAMRA azideSynthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI buffer (10x)Thermo ScientificB28
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Acros Organics42058
Tris-HClGerbu1028
Tris-X (TRIS-base)Gerbu1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)Sigma-Aldrich762342

参考文献

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