在小鼠肺压力容积曲线的测量

摘要

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung’s structural changes with developing pathology.

摘要

近几十年来鼠标已经成为了各种肺部疾病的主要动物模型。在肺气肿或纤维化模型中，必不可少的表型变化，最好是由变化在肺弹性测量评估。到最好的理解小鼠这样的病状底层的具体机制，它是必不可少的，以使功能测量能反映显影病理。虽然有许多方法测量弹性，经典方法是，总肺压力容积（PV）的曲线进行过肺容积的整个范围。这种测量已经取得了对成人肺部几乎所有的哺乳动物物种距今近100年了，这样的PV曲线也是在胎儿肺发育肺表面活性物质功能的发现和了解发挥了重要作用。不幸的是，这样的总的PV曲线还没有得到广泛报道，在小鼠，尽管事实上，它们可以提供对macrosc有用信息在肺的结构变化OPIC影响。尽管局部的PV曲线测量刚刚变化肺容积有时报道，没有绝对的体积的量度，总的PV曲线的非线性性质使得这些部分的那些非常难以解释。在本研究中，我们描述一个标准化的方法来测量总PV曲线。我们然后测试这些曲线来检测在两个常见肺病理学，肺气肿和纤维化改变小鼠肺结构的能力。结果显示，与这些疾病预期的结构性变化一致的几个变量显著的变化。小鼠肺PV曲线的该测量从而提供了一种简单的装置来监视随时间变化的病理生理改变和治疗程序的潜在影响的进展。

引言

鼠标是目前各种肺部疾病的主要动物模型。肺气肿或纤维化模型，基本的表型变化，最好通过测量变化肺弹性评估。虽然有许多方法测量弹性，经典方法是总压力容积（PV）曲线从残气量（RV）的测量，以总肺活量（TLC）的那个。这种测量已经取得了对成人肺部几乎所有的哺乳动物物种距今近100年^1-3。这样的PV曲线也是在胎儿肺发育^4-7肺表面活性物质功能的发现和了解发挥了重要作用。尽管PV曲线的重要性，因为肺的表型的测定，还没有标准的方式来执行这种测量。它已经做了简单的通过充气和放气与离散的步骤肺（等待可变的时间后，每个平衡）或泵的可以连续地充气和放气的肺。的PV曲线往往是做在零和一些用户自定义的肺活量之间的体积范围内，但报道的不同实验室每个压力容积循环的持续时间已经非常可变的，从几秒⁸变到²小时。一些研究者参考本总肺PV曲线为静态或准静态的，但这些都是质量方面，提供小的洞察力，并且它们在这里不使用。此外，PV曲线并没有被广泛报道，在小鼠，尽管事实上，它可以提供关于在肺结构变化的宏观效应的有用信息。

几个问题导致变异PV曲线收购，包括:通货膨胀和通货紧缩1）速度; 2）压力为游览通胀和通缩;和3）的装置，以确定一个绝对肺容积的测量。在该方法中存在这里，3毫升/分钟的速度被选为一项妥协即，成为不能太短，以反映与正常的通风，而不是太慢关联的动态弹性，以使测量不切实际的，学习大队列时尤为如此。由于标称总肺活量在C57BL / 6小鼠的健康是1.2毫升⁹的量级，这种速度通常允许两个完整的闭合回路的PV将在约1.5分钟完成。

在其中，PV曲线已经报道了在扩展文献中，使用的峰值充气压力一直非常可变的，从低到20变化到40厘米水柱₂ O.这个变异性的一部分可能与物种，但设置的PV曲线压力上限的一个主要目标是充气肺总肺活量（TLC）或最大的肺容积。在TLC在人类是由最大的志愿工作，个人可以做出规定，但不幸的是这可能从来没有在任何动物模型中被复制。因此，在实验PV曲线的最大音量是威慑由最大压力由研究者任意设定开采。我们的目标是建立一个压力，其中所述PV曲线是平坦的，但不幸的是哺乳动物的肺PV曲线的膨胀肢是从不平坦的。所以大多数研究者设定一个压力，其中所述膨胀曲线开始变平基本上，典型30厘米H ₂ O在小鼠，然而，PV曲线更为复杂与充气肢双驼峰，并且其中该膨胀肢常常仍然在30厘米水柱_{2 O} ¹⁰急剧上升，所以30不是为一个好的结束点PV曲线。出于这个原因，我们使用35厘米的H ₂ O为压力极限为鼠标PV曲线，这是在该充气四肢我们已审查所有菌株的开始变平的压力。

由于PV曲线本身很非线性的，光伏环的外观将取决于从弯道开始处的体积。一些商业通风允许用户做大型光伏循环，从初始的F钢筋混凝土，但如果将FRC体积是未知的话，是不可能解读的改变与任何病理，例如PV曲线，因为这些变化可以简单地从开始体积的变化造成的，而不是结构改变在肺中。因此，没有一个绝对量的测量，PV曲线几乎是不可能的解释，因此没有什么效用。虽然，有几种方法来测量肺容积，这些往往笨重，需要特殊的设备。在这里所描述的简单的方法，所述PV曲线的体内脱气过程后从零开始体积。

总之，本文说明了一个简单的方法，以规范肺PV曲线的测量在小鼠肺，并限定可从该曲线被链接到肺的结构来计算几个度量。的PV曲线因此提供肺功能测试具有在能够检测小鼠通讯表型的结构变化的直接应用肺疾病如肺气肿和纤维化。

研究方案

约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准的所有动物的协议。

1.设备

复合体系建立起来，准备测量的PV曲线示于图1。

1. 体积测量:
   1. 通过使用注射泵用开关，其允许用户在到达压力极限后，迅速扭转泵产生膨胀和收缩的恒定速率。鼠标PV曲线，使用非常抹了油5毫升玻璃注射器与初始体积（前通胀）设置3毫升空气。 3毫升足够大，在几乎所有的鼠标PV曲线来衡量卷。
   2. 测量由泵输送通过附加的线性差动变压器到泵壳体，具有一小的传感器杆连接到所述移动针筒柱塞的体积。
      注意:实证手段来校正在系统中气体压缩光伏立方米下被描述RVE记录部分。
2. 压力测量:
   1. 使用标准的廉价的压力表，射程0-60厘米H ₂ O（0-1 PSI）。
3. 记录测量:
   1. 为了记录PV曲线使用任何数字录音机XY能力（ 如 PowerLab系统）。设置一个信道来记录修正量信号和另一信道来记录跨肺压（PTP），以图表的PV曲线。使用一个桥前置放大器连接到主PowerLab系统来测量压力。 0-40厘米水柱_{2 O}校准压力通道，并从0-3毫升校准音量通道。

2.修正了天然气压缩

注意:这是在一个关键的初始步骤中的设置，因为随着压力的增加，气体体积减小，并且空气递送到小鼠的这样的体积会比SYR的位移越来越少英格桶。

1. 关闭将光伏系统连接到肺部的活塞，因此没有气体能离开系统。开始输注，并观察是否刻录机上的校正量的信道表示任何可测量的变化，因为压力增加至约40cm _的 H ₂ O.如果是这样，那么正确的，因为在接下来的步骤。
   1. 正确的气体压缩经验从活塞位移测量减去（ 即未修正量）比例通胀压力的一个术语。做一个PowerLab系统的信道（被称为维生素C），这显示数量减去信号系数倍的压力。
   2. 确定公式中的系数。首先，初步猜测，打开图表记录，并启动泵。由于通胀油管是密封的，调整压力系数倍增，使Vc的通道读取零0-40厘米H ₂ O.压力上升如果这样下去，向上或向下，只需调整校正系数，直到横盘在这个压力范围内。这种校正因子将始终是相同的，如果同一3毫升开始在注射器容量不改变。

小鼠3实验测试

1. 程序小鼠PV曲线的测量结果。所有的动物协议批准了约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会。
   1. 麻醉小鼠（C57BL / 6小鼠在6-12周龄）用氯胺酮（90毫克/千克）和赛拉嗪（15毫克/千克），并由于没有反射运动的确认麻醉。
      注意:PV曲线可以在麻醉的小鼠中完成，在不到10分钟，是一个终端程序。
   2. Tracheostomize小鼠与18G的存根针管。通过一个小切口，在皮肤上的气管，定位气管，然后做一个小切口，在气管，可插入存根针的地方做到这一点。用线扎固定套管。
   3. 让老鼠呼吸100％的氧气，至少4分钟。这可以是通过自主呼吸从袋中，或用换气名义上设定为0.2ml，在150次呼吸/分钟的潮气量。
   4. 关闭气管插管，并允许3-4分钟为鼠标吸收所有的氧气。此氧气吸收过程引起的动物，并在肺¹¹的几乎完整的脱气的死亡。通过测量与心电图电极或直接观察心跳停止确认的小鼠死亡。
   5. 一旦肺的脱气完成并且肺容积为零时，开始充气与室内空气在所述注射器泵的肺以3毫升/分钟的速率。显示器上的数字记录的压力轨迹，并且当它到达35厘米H ₂ O，反向泵浦。
   6. 按照通缩的曲线，直到压力达到负10厘米H ₂ O，而此时的气道已经崩溃，捕捉空气中的肺泡防止进一步的减排量。马上倒T他再次泵，使肺reinflate的崩溃航空公司公开赛。这种异构开放是嘈杂看通胀肢体这个第二通货膨胀的初始部分通常明显。
   7. 当压力再次达到35厘米H ₂ O，反转泵方向，并持续到2日通货紧缩肢体达到0厘米H ₂ O.放气肺然后停泵。
   8. 查看的压力和流量，并在PV曲线的PowerLab图表记录。然后分析PV曲线来检测在肺实质不同的肺病理学发生表型的改变。

结果

虽然为光伏曲线的步骤中演示了仅用于控制健康小鼠的视频中，我们检查了PV曲线来检测小鼠的功能和病理变化与两个不同的常见病症，肺气肿和纤维化的能力。这些传统车型的详细信息在其他地方^12,13描述。很简单，麻醉用3％异氟醚后肺气肿是由3个或6ü猪胰弹性蛋白酶灌输到气管引起的，研究3周后，和纤维化是由0.05ü博莱霉素灌输到气管引起的，在此之后的研究2周侮辱。

讨论

在本文中一个简单的可重复的方法已经描述在小鼠中测定表型肺的弹性，总肺的PV曲线的经典方法。这样的曲线是有助于肺表面活性物质的发现及其在肺部提供稳定的重要性。这里，示出了如何在PV曲线也提供以测量在成年小鼠肺有关肺弹性几个变量的装置是有用的。有在所有的变量在两个常用的小鼠模型高度显著变化以产生在小鼠肺中的病理改变。以下部分简要讨论的变化中的每个所测量的变量...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Syringe Pump	Harvard Apparatus	55-2226	Infuse/Withdraw syringe pump
Pump 22 Reversing Switch	Harvard Apparatus	552217	included with pump
Linear displacement transformer	Trans-Tek, Inc.	0244-0000
5 mL glass syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Digital recorder	ADInstruments	PL3504	Several other possible vendors
Bridge Amp Signal Conditioner	ADInstruments	FE221
Gas tank,100% oxygen	Airgas, Inc		Any supplier or hospital source will work
Pressure Transducer - 0-1psi  millivolt output	Omega Engineering	PX-137	Range: ≈0-60 cmH2O