Misura della curva di pressione-volume in mouse polmoni

Riepilogo

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung’s structural changes with developing pathology.

Abstract

Negli ultimi decenni topo è diventato il modello animale primario di una varietà di malattie polmonari. Nei modelli di enfisema o fibrosi, le variazioni fenotipiche essenziali sono meglio valutati mediante misurazione delle variazioni di elasticità polmonare. Per comprendere meglio i meccanismi specifici alla base di tali patologie nei topi, è indispensabile effettuare misurazioni funzionali che possono riflettere la patologia sviluppo. Sebbene vi siano molti modi per misurare l'elasticità, il metodo classico è quello del polmone pressione volume totale (PV) Curva fatto sull'intero intervallo di volumi polmonari. Questa misura è stata fatta su polmoni adulti da quasi tutte le specie di mammiferi risalenti quasi 100 anni, e tali curve fotovoltaici anche svolto un ruolo importante nella scoperta e la comprensione della funzione del surfattante polmonare in sviluppo polmonare fetale. Purtroppo, tali curve totale PV non sono stati ampiamente riportati nel topo, nonostante il fatto che essi possono fornire informazioni utili sul macroscEffetti OPIC di cambiamenti strutturali nel polmone. Sebbene curve parziali FV misura solo le variazioni di volume polmonare sono talvolta riportati, senza misura del volume assoluto, la natura non lineare della curva totale PV rende questi parziali molto difficile interpretazione. Nel presente studio, si descrive un metodo standardizzato per misurare la curva totale PV. Abbiamo poi testato la capacità di queste curve per rilevare i cambiamenti nella struttura del polmone del mouse in due patologie polmonari comuni, enfisema e fibrosi. I risultati hanno mostrato cambiamenti significativi in ​​più variabili coerenti con i cambiamenti strutturali attesi con queste patologie. Questa misurazione della curva PV polmone nei topi fornisce pertanto un mezzo semplice per monitorare la progressione dei cambiamenti fisiopatologici nel tempo e l'effetto potenziale di procedure terapeutiche.

Introduzione

Il mouse è ora il modello animale primario di una varietà di malattie polmonari. Nei modelli di enfisema o fibrosi, i cambiamenti fenotipici essenziali sono meglio valutati misurando le variazioni di elasticità polmonare. Sebbene vi siano molti modi per misurare l'elasticità, il metodo classico è quello della curva di pressione-volume totale (PV) misurata dal volume residuo (RV) alla capacità polmonare totale (TLC). Questa misura è stata fatta su polmoni adulti da quasi tutte le specie di mammiferi risalenti quasi 100 anni ^1-3. Tali curve PV anche svolto un ruolo importante nella scoperta e la comprensione della funzione del surfattante polmonare nello sviluppo del polmone fetale ^4-7. Nonostante l'importanza della curva PV come misura del fenotipo del polmone, non vi è stato alcun modo standardizzato effettuare tale misurazione. E 'stato fatto semplicemente gonfiando e sgonfiando polmone con passi discreti (attesa per un tempo variabile equilibramento dopo ogni) o con pompepuò continuamente gonfiare e sgonfiare il polmone. La curva PV è spesso fatto in un intervallo di volume tra zero e alcune capacità polmonare dall'utente definire, ma la durata di ogni ciclo pressione volume riportato da diversi laboratori è estremamente variabile, che varia da pochi secondi a ⁸ ore ^2. Alcuni ricercatori si riferiscono a questa curva totale PV polmone come statico o quasi statica, ma questi sono termini qualitativi che offrono visione poco, e che non sono usati qui. Inoltre, la curva PV non è stato ampiamente riportato nel topo, nonostante il fatto che essa può fornire informazioni utili sugli effetti macroscopici di cambiamenti strutturali nel polmone.

Diversi problemi hanno portato a variabilità acquisizione curva PV tra cui: 1) il tasso di inflazione e la deflazione; 2) le escursioni di pressione per l'inflazione e la deflazione; e 3) mezzi per la determinazione di una misura assoluta volume polmonare. Nel metodo qui presenti, una velocità di 3 ml / min è stato scelto come compromise, non essendo troppo breve da riflettere l'elasticità dinamica associata con ventilazione normale e non troppo lento da rendere impraticabile la misura, in particolare quando si studia grandi coorti. Poiché una capacità nominale polmonare totale in un C57BL / 6 sana mouse è dell'ordine di 1,2 ml ^9, questo tasso consente tipicamente due completo chiusi PV cicli essere fatto in circa 1,5 min.

In letteratura estesa in cui sono state riportate le curve PV, la pressione di gonfiaggio di picco utilizzato è stato estremamente variabile, variando da un minimo di 20 ad oltre 40 cm H ₂ O. Una parte di questa variabilità può essere correlato alla specie, ma un obiettivo primario di impostare il limite di pressione superiore per le curve PV è di gonfiare il polmone di capacità totale polmonare (TLC), o il volume polmonare massimo. La TLC nell'uomo è definita dallo sforzo massimale volontaria un individuo può fare, ma purtroppo non può mai essere duplicato in qualsiasi modello animale. Così, il volume massimo in curve sperimentali FV è scoraggiareminato da una pressione massima fissato arbitrariamente dallo sperimentatore. L'obiettivo è quello di impostare una pressione in cui la curva PV è piatta, ma purtroppo l'arto inflazione di una curva PV polmone dei mammiferi non è mai piatta. Quindi molti ricercatori impostare una pressione in cui la curva di gonfiaggio inizia ad appiattirsi sostanzialmente, genere il 30 cm H ₂ O. Nel topo, tuttavia, la curva PV è ancora più complessa con una doppia gobba sull'arto gonfiaggio, e dove tale parte dell'inflazione spesso ancora a picco al 30 cm H ₂ O ^10, quindi 30 non è un punto finale per il buon curva PV. Per questo motivo, usiamo 35 centimetri H ₂ O come il limite di pressione per la curva del mouse PV, che è una pressione alla quale gli arti gonfiaggio di tutti i ceppi che abbiamo esaminato cominciano ad appiattirsi.

Poiché la curva PV è molto lineare, l'aspetto di un loop PV dipenderà dal volume da dove la curva inizia. Alcuni ventilatori commerciali consentono agli utenti di fare grandi anse fotovoltaici, partendo da FRC, ma se il volume FRC è sconosciuto, allora è impossibile interpretare variazioni di tale curva PV con qualsiasi patologia, poiché questi cambiamenti potrebbero semplicemente derivare da un cambiamento di volume di partenza, e non alterazioni strutturali nel polmone. Così, senza una misura del volume assoluto, curve PV sono quasi impossibili da interpretare e quindi hanno scarsa utilità. Anche se, ci sono diversi modi per misurare i volumi polmonari, questi sono spesso ingombranti e richiedono attrezzature speciali. Nella semplice metodo qui descritto, la curva PV inizia a volume zero dopo una procedura di degasaggio in vivo.

In sintesi, questo lavoro dimostra un metodo semplice per standardizzare la misurazione della curva PV polmonare nel polmone del mouse, e definisce alcuni parametri che possono essere calcolati da questa curva che sono collegate alla struttura del polmone. La curva PV fornisce quindi un test di funzionalità polmonare, che ha applicazione diretta di essere in grado di rilevare i cambiamenti strutturali fenotipiche nei topi con commsulle patologie polmonari come l'enfisema e fibrosi.

Protocollo

L'Università di cura e utilizzo Comitato Animal Johns Hopkins ha approvato tutti i protocolli di animali.

1. apparecchiature

Il sistema composito costituito, pronti per misurare la curva PV è mostrato in Figura 1.

1. Misura Volume:
   1. Generare un tasso costante di gonfiaggio e sgonfiaggio utilizzando una pompa a siringa con un interruttore che consente all'utente di invertire rapidamente la pompa dopo aver raggiunto i limiti di pressione. Per le curve del mouse FV, utilizzare un molto leggermente unta siringa di vetro 5 ml con il volume iniziale (prima di inflazione) fissato a 3 ml di aria. 3 ml è sufficientemente ampio per misurare i volumi in quasi tutte le curve del mouse fotovoltaici.
   2. Misurare il volume erogato dalla pompa collegando un trasformatore differenziale lineare al corpo pompa, con una piccola asta sensore collegato alla siringa movimento stantuffo.
      Nota: Un mezzo empirici per correggere per la compressione del gas nel sistema è descritto sotto il cu PVsezione registrazione rve.
2. Misurazione della pressione:
   1. Utilizzare un manometro economico standard con una gamma di 0-60 cm H ₂ O (0-1 PSI).
3. Misura di registrazione:
   1. Per registrare la curva PV utilizzare qualsiasi registratore digitale con funzionalità XY (ad esempio, Powerlab). Impostare un canale per registrare il segnale volume corretto e un altro canale per registrare la pressione transpolmonare (PTP), al fine di rappresentare graficamente la curva PV. Utilizzare un preamplificatore ponte che collega alla Powerlab principale per misurare la pressione. Calibrare il canale di pressione 0-40 cm H ₂ O, e calibrare il canale del volume da 0-3 ml.

2. Correzione per Compressione Gas

Nota: Questa è una fase critica iniziale nel set up, poiché, come la pressione aumenta, diminuisce di volume di gas, e quindi il volume d'aria erogata al mouse sarà sempre inferiore lo spostamento del syringe barile.

1. Chiudere il rubinetto che collegherà l'impianto fotovoltaico ai polmoni, in modo che nessun gas può lasciare il sistema. Avviare l'infusione e osservare se il canale Volume corretto sul registratore mostra eventuali cambiamenti misurabili come la pressione aumenta a circa 40 cm H ₂ O. Se è così, allora preciso nei passaggi successivi.
   1. Corretta per la compressione del gas empiricamente sottraendo dalla misura dello spostamento dello stantuffo (cioè, il volume non corretta) un termine proporzionale alla pressione di gonfiaggio. Effettuare questa operazione su un canale Powerlab (chiamato Vc) per mostrare il segnale volume di meno di un coefficiente volte la pressione.
   2. Determinare il coefficiente nell'equazione. In primo luogo, fare un tentativo iniziale, ruotare il grafico registrazione su, e avviare la pompa. Poiché il tubo di gonfiaggio è sigillato, regolare il moltiplicatore coefficiente di pressione per rendere il canale Vc leggere zero la pressione sale 0-40 cm H ₂ O. Se si va su o giù, semplicemente regolare il fattore di correzione fino arimane piatta su questo campo di pressione. Questo fattore di correzione sarà sempre la stessa, se le stesse 3 ml partire volume nella siringa non è cambiato.

3. Le prove sperimentali in topi

1. Procedura per la misurazione della curva PV nei topi. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dall'Università Cura e uso Comitato Animal Johns Hopkins.
   1. Anestetizzare topi (C57BL / 6 topi a 6-12 settimane di età) con ketamina (90 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg), e confermare l'anestesia dall'assenza di movimento riflesso.
      Nota: La curva PV può essere completato in topi anestetizzati in meno di 10 minuti ed è una procedura terminale.
   2. Tracheostomize i topi con un 18 G stub ago cannula. A tale scopo, una piccola incisione nella pelle sovrastante la trachea, localizzare la trachea, poi facendo una piccola fessura nella trachea, in cui l'ago stub può essere inserito. Fissare la cannula legando con filo.
   3. Lasciare i topi a respirare 100% di ossigeno per almeno 4 min. Questo può avvenire tramite la respirazione spontanea da un sacchetto o con un ventilatore nominalmente impostato con un volume corrente di 0,2 ml a 150 respiri / min.
   4. Chiudere la cannula tracheale e lasciare 3-4 min per il mouse di assorbire tutto l'ossigeno. Questa procedura assorbimento di ossigeno risulta la morte degli animali e in un degasaggio quasi completa del polmone ^11. Conferma morte del mouse misurando la cessazione del battito cardiaco con elettrodi ECG o osservazione diretta.
   5. Una volta che il degasaggio del polmone è completa e il volume polmonare è zero, cominciare a gonfiare il polmone con aria ambiente nella pompa a siringa ad una velocità di 3 ml / min. Monitorare la traccia pressione sul registratore digitale, e quando raggiunge i 35 cm H ₂ O, invertire la pompa.
   6. Seguire la curva di deflazione fino pressione raggiunge negativo del 10 cm H ₂ O, momento in cui le vie aeree sono crollati, intrappolando l'aria in alveoli che impediscono un'ulteriore riduzione del volume. Invertire immediatamente tegli pompa di nuovo, consentendo al polmone per rigonfiare le vie respiratorie crollati aprire. Questa apertura eterogenea è normalmente evidenti dalla rumorosa dell'arto gonfiaggio guardando la parte iniziale di questo 2a gonfiaggio.
   7. Quando la pressione raggiunge nuovamente 35 centimetri H ₂ O, invertire la direzione della pompa, e continuare a sgonfiare il polmone fino a questo 2a sgonfiaggio arto raggiunge 0 cm H ₂ O. Quindi fermare la pompa.
   8. Visualizza il record grafico PowerLab di pressione e portata e la curva PV. Poi analizza la curva PV per rilevare i cambiamenti fenotipici di parenchima polmonare che si verificano con diverse patologie polmonari.

Risultati

Anche se la procedura per le curve FV è dimostrato nel video solo per topi sani di controllo, abbiamo esaminato la capacità della curva PV per rilevare cambiamenti funzionali e patologici in topi con due diverse patologie comuni, enfisema e fibrosi. I dettagli di questi modelli tradizionali descritte altrove ^12,13. Molto brevemente, dopo l'anestesia con il 3% isoflurano l'enfisema è stato causato da 3 o 6 U elastasi pancreatica porcina instillato nella trachea e ha studiato tre settimane più tardi...

Discussione

In questo documento un metodo semplice e riproducibile è stato descritto per misurare in topi un metodo classico di elasticità fenotipizzazione polmonare, la curva totale PV polmonare. Tali curve sono state fondamentali per la scoperta del surfattante polmonare e la sua importanza nel fornire stabilità al polmone. Qui è mostrato come la curva PV è anche utile nel fornire un mezzo per misurare diverse variabili collegati elasticità polmonare nei polmoni topo adulto. Ci sono stati cambiamenti molto significativi in ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Syringe Pump	Harvard Apparatus	55-2226	Infuse/Withdraw syringe pump
Pump 22 Reversing Switch	Harvard Apparatus	552217	included with pump
Linear displacement transformer	Trans-Tek, Inc.	0244-0000
5 mL glass syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Digital recorder	ADInstruments	PL3504	Several other possible vendors
Bridge Amp Signal Conditioner	ADInstruments	FE221
Gas tank,100% oxygen	Airgas, Inc		Any supplier or hospital source will work
Pressure Transducer - 0-1psi  millivolt output	Omega Engineering	PX-137	Range: ≈0-60 cmH2O