Измерение давления объема Curve в мышиных легких

Резюме

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung’s structural changes with developing pathology.

Аннотация

В последние десятилетия мышь стала основной модели на животных из различных легочных заболеваний. В моделях эмфиземы или фиброза, существенные фенотипические изменения лучше всего оценивать путем измерения изменений в эластичности легких. Чтобы лучше понять конкретные механизмы, лежащие в основе этих патологий у мышей, важно, чтобы функциональные измерения, которые могут отражать проявляющего патологии. Хотя есть много способов измерить эластичность, классический метод является то, что из общего легких давление-объем (PV) кривая сделано во всем диапазоне объемов легких. Это измерение было сделано на взрослых легких почти из всех видов млекопитающих, начиная почти 100 лет, и такие кривые PV также сыграли важную роль в открытии и понимания функции легочного сурфактанта в развитии легких плода. К сожалению, такие общие кривые PV не были широко представлены в мыши, несмотря на то, что они могут предоставить полезную информацию о macroscOPIC эффекты структурных изменений в легких. Хотя частичные кривые PV измерения только изменения в объеме легких, иногда сообщалось, без меры абсолютного объема, нелинейный характер общей кривой PV делает эти частичные очень трудно интерпретировать. В настоящем исследовании мы описываем стандартный способ измерить общую кривую PV. Затем мы протестировали способность этих кривых для обнаружения изменений в мыши структуры легких в двух патологий общего легких, эмфизема и фиброз. Результаты показали значительные изменения в нескольких переменных в соответствии с ожидаемыми структурными изменениями с этих патологий. Это измерение кривой легких PV мышей таким образом, обеспечивает простой способ контролировать прогрессирование патофизиологических изменений с течением времени и потенциального влияния лечебных процедур.

Введение

Мышь теперь основной модели на животных из различных легочных заболеваний. В моделях эмфиземы или фиброза, существенные фенотипические изменения лучше всего оценивать путем измерения изменения в эластичности легких. Хотя есть много способов измерить эластичность, классический метод является то, что общее давление-объем (PV) кривой, измеренной от остаточного объема (RV) в общей емкости легких (TLC). Это измерение было сделано на взрослых легких почти из всех видов млекопитающих, начиная почти 100 лет ^1-3. Такие кривые PV также сыграли важную роль в открытии и понимания функции легочного сурфактанта в развитии легких плода ^4-7. Несмотря на важность ФВ кривой, как измерение фенотипа лёгкого, не было никакого стандартный способ выполнить это измерение. Это было сделано просто путем надувания и сдувания легкого с дискретными шагами (ожидание определенного времени, для уравновешивания после каждого) или с помощью насосов, чтоможет непрерывно надуть и выкачать легких. Кривая PV часто делается по объему диапазоне от нуля до некоторого пользовательских определить емкость легких, но длительность каждого тома контура давления сообщают разные лаборатории был чрезвычайно разнообразен, варьируется от нескольких секунд ⁸ до часа ^2. Некоторые исследователи относятся к этой общей кривой легких PV также статической или квазистатической, но это все качественные условия, которые предлагают немного понять, и они здесь не используются. Кроме того, кривая PV не была широко сообщалось в мыши, несмотря на то, что она может дать полезную информацию о макроскопических эффектов структурных изменений в легких.

Некоторые вопросы привели к изменчивости в приобретении кривой PV в том числе: 1) уровень инфляции и дефляции; 2) экскурсии давления для надувания и сдувания; и 3) средства для определения абсолютного измерения объема легких. В методе присутствуют здесь, скорость 3 мл / мин была выбрана в качестве компромиссного соглашения,е, будучи не слишком коротким, чтобы отражать динамический эластичность, связанный с нормальной вентиляции и не слишком медленно, чтобы сделать измерения непрактично, особенно при изучении больших когорт. С номинальной общая емкость легких в / 6 здорового мыши C57BL порядка 1,2 мл ^9, этот показатель, как правило, позволяет два полных закрыт PV петли должно быть сделано примерно в 1,5 мин.

В расширенном литературе, где кривые PV были зарегистрированы, пиковое давление инфляции используется уже очень разнообразны, варьируя от самого низкого показателя 20 до более чем 40 см Н ₂ О. Часть этой изменчивости может быть связана с видами, но основная цель установки верхнего предела давления для кривых PV является раздувать легкие к общей емкости легких (TLC), или максимального объема легких. ТСХ в организме человека определяется максимальным усилием добровольного человек может сделать, но, к сожалению, это никогда не может быть дублирована в любой модели на животных. Таким образом, максимальный объем в экспериментальных кривых PV отговариваетделяется максимального давления произвольно установленного следователя. Цель состоит в том, чтобы установить давление, где кривая PV является плоской, но, к сожалению, инфляция конечностей млекопитающего кривой легких PV никогда не плоские. Так большинство исследователей установить давление, где кривая инфляции начинает существенно сгладить, обычно 30 см H ₂ O. У мышей, однако, кривая PV является еще более сложной с двуспальной горб на инфляции конечности, и, где это инфляция конечностей зачастую все еще ​​резко возрастает в 30 см H ₂ O ^10, так что 30 это не очень хорошая конечная точка PV кривой. По этой причине, мы используем 35 см H ₂ O в качестве предела давления для кривой мыши PV, который является давление, при котором инфляция конечности всех штаммов рассмотренных нами начинают сглаживаться.

Поскольку сама кривая ПВ очень нелинейной, появление контура PV будет зависеть от объема, из которого начинается кривая. Некоторые коммерческие вентиляторы позволяют пользователям делать большие петли PV, начиная с FRC, но если объем FRC неизвестно, то это невозможно интерпретировать изменения в такой PV кривой с какой-либо патологии, так как эти изменения могут просто связаны с изменением в стартовом объем, а не структурные изменения в легких. Таким образом, без абсолютного измерения объема, кривые PV почти невозможно интерпретировать и, таким образом маленькая утилита. Хотя существует несколько способов измерения объема легких, они часто громоздки и требуют специального оборудования. В простой подход, описанный здесь, кривая ПВ начинает при нулевом объеме после естественных процедуры дегазации в.

Таким образом, в работе показано, простой способ стандартизации измерений кривой легких PV в легких мыши, и определяет несколько метрик, которые могут быть вычислены из этой кривой, которые связаны с легочной структуры. Кривая PV, таким образом, обеспечивает проверку функции легких, что имеет непосредственное применение в возможности обнаружить фенотипических структурные изменения у мышей с коммна патологии легких, таких как эмфизема и фиброз.

протокол

Университет Комитет Уход за животными и использование Johns Hopkins утвердил все протоколы животных.

1. Оборудование

Сложная система создана, готов к измерению кривой PV показано на рисунке 1.

1. Измерение объема:
   1. Создать постоянную скорость инфляции и дефляции, используя шприцевой насос с выключателем, что позволяет пользователю быстро переломить насос после достижения предельных значений давления. Для кривых мыши П.В., использовать очень слегка смазанный 5 мл стеклянный шприц с первоначального объема (до инфляции), установленной на 3 мл воздуха. 3 мл достаточно большой, чтобы измерить объемы почти во всех кривых мыши PV.
   2. Измерение объема доставлено с помощью насоса путем присоединения линейного дифференциального трансформатора с корпусом насоса, с небольшим стержнем датчика, подключенного к подвижной поршень шприца.
      Примечание: эмпирические средства для коррекции сжатия газа в системе описывается под PV кубRVE раздел запись.
2. Измерение давления:
   1. Используйте стандартный датчик недорогой давления с диапазоном 0-60 см H ₂ O (0-1 PSI).
3. Запись измерения:
   1. Для записи кривой PV использовать любой цифровой рекордер с возможностями XY (например, Powerlab). Установка одного канала для записи скорректированный сигнал громкости и другой канал для записи давление транспульмональной (PTP), для того, чтобы построить график кривой PV. Используйте предусилитель мост, который соединяет в основной Powerlab для измерения давления. Калибровка канал давления от 0-40 см Н ₂ О и калибровки громкости канала от 0-3 мл.

2. Коррекция Сжатие газа

Примечание: Это критический первый шаг в настройке, так как при увеличении давления уменьшается объем газа, а значит, объем воздуха, подаваемого к мыши будет все меньше и меньше, чем смещение СырИнге баррель.

1. Закройте кран, который будет подключаться к фотоэлектрической системы в легкие, поэтому газ не может покинуть систему. Начните настой и наблюдать, если приведенный объем каналов на видеомагнитофоне показывает какие-либо заметных изменений по мере увеличения давления до 40 см Н ₂ О. Если это так, то правильно, как на следующих этапах.
   1. Правильный код для сжатия газа эмпирически путем вычитания из измерения на поршень смещения (т.е. без поправки объем) член, пропорциональный инфляционного давления. Сделайте это на Powerlab канала (так называемый VC), чтобы показать Громкость сигнала минус коэффициент раза давления.
   2. Определить коэффициент в уравнении. Во-первых, сделать начальное предположение, включите диаграмму записи и начинайте насос. С трубки инфляция запечатана, регулировать коэффициент давления множитель, чтобы сделать канал Vc показывать ноль, как давление поднимается от 0-40 см Н ₂ О. Если она идет вверх или вниз, просто настройте поправочный коэффициент до негоостается плоским в этом диапазоне давления. Этот поправочный коэффициент будет всегда то же самое, если те же самые 3 мл исходного объема в шприце не изменяется.

3. Экспериментальные тесты у мышей

1. Процедура измерения кривой PV у мышей. Все протоколы животных были утверждены университета Комитета по уходу и использованию Джонса Хопкинса животного.
   1. Обезболить мышей (C57BL / 6 мышей в 6-12-недельного возраста) с кетамином (90 мг / кг) и ксилазина (15 мг / кг), и подтвердить анестезии отсутствием рефлекторной движения.
      Примечание: Кривая PV может быть завершена в анестезированных мышей менее чем 10 мин, а это терминал процедуры.
   2. Tracheostomize мышей с 18 г заглушки иглы канюли. Для этого, сделав небольшой разрез в коже вышележащих трахеи, размещение в трахею, а затем делает небольшой разрез в трахее, где заглушка иглы может быть вставлен. Закрепите канюли, связывая с резьбой.
   3. Разрешить мышей дыхания 100% кислорода в течение по меньшей мере 4 мин. Это может быть с помощью спонтанного дыхания из мешка или с вентилятором, номинально установлен с дыхательным объемом 0,2 мл в 150 вдохов / мин.
   4. Закрыть трахеи канюли и позволяют 3-4 мин для мыши, чтобы поглотить весь кислород. Эта процедура поглощения кислорода приводит к гибели животных и в почти полной дегазации легких ^11. Подтвердите смерть мыши путем измерения прекращение сердцебиения с электродов ЭКГ или непосредственного наблюдения.
   5. После дегазации легких является полным и объем легких равен нулю, начинают раздувания легких комнатным воздухом в шприцевой насос со скоростью 3 мл / мин. Монитор след давления на цифровой рекордер, и когда она достигает 35 см H ₂ O, обратный насос.
   6. Следуйте кривую дефляции до тех пор, пока давление не достигнет негативного 10 см H ₂ O, и к этому времени Airways рухнули, захвата воздуха в альвеолах, препятствующих дальнейшему снижению громкости. Немедленно отменить тон насоса снова, позволяя легких, reinflate как открыть рухнувшего дыхательных путей. Это гетерогенная открытие, как правило, очевидны шумной глядя инфляции конечности в начальной части этого 2 инфляции.
   7. Когда давление снова достигает 35 см H ₂ O, изменить направление насоса, и продолжать выкачивать легких до этого 2 дефляция конечностей не достигает 0 см H ₂ O. Затем остановите насос.
   8. Просмотр PowerLab диаграммы запись давления и расхода и кривой PV. Тогда проанализировать кривую PV для определения фенотипических изменений в легочной паренхимы, которые происходят с различной патологией легких.

Результаты

Хотя процедура для кривых PV показано в видео только для управления здоровых мышей, мы исследовали способность кривой PV для обнаружения функциональных и патологических изменений у мышей с двумя различными распространенными патологиями, эмфизема и фиброз. Подробная информация об этих ...

Обсуждение

В этой статье просто воспроизводимый метод был описан для измерения у мышей классический метод упругости легких, фенотипирование общей кривой легких PV. Такие кривые сыграли важную роль в открытии легочного сурфактанта и его значение в обеспечении стабильности легких. Здесь показано, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Syringe Pump	Harvard Apparatus	55-2226	Infuse/Withdraw syringe pump
Pump 22 Reversing Switch	Harvard Apparatus	552217	included with pump
Linear displacement transformer	Trans-Tek, Inc.	0244-0000
5 mL glass syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Digital recorder	ADInstruments	PL3504	Several other possible vendors
Bridge Amp Signal Conditioner	ADInstruments	FE221
Gas tank,100% oxygen	Airgas, Inc		Any supplier or hospital source will work
Pressure Transducer - 0-1psi  millivolt output	Omega Engineering	PX-137	Range: ≈0-60 cmH2O