Medição da curva pressão-volume no mouse Lungs

Resumo

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung’s structural changes with developing pathology.

Resumo

Nas últimas décadas, o ratinho tornou-se o modelo animal primária de uma variedade de doenças pulmonares. Em modelos de enfisema ou fibrose, as alterações fenotípicas essenciais são melhor avaliada por medição das alterações na elasticidade do pulmão. Para melhor compreender os mecanismos específicos subjacentes a essas patologias em camundongos, é essencial para fazer medições funcionais que podem refletir a patologia em desenvolvimento. Embora existam muitas maneiras de medir a elasticidade, o método clássico é o do pulmão pressão-volume total (PV) curva feito ao longo de toda a gama de volumes pulmonares. Essa medição foi feita no pulmão adulto de quase todas as espécies de mamíferos que remonta quase 100 anos, e essas curvas PV também desempenhou um papel importante na descoberta e compreensão da função do surfactante pulmonar em desenvolvimento pulmonar fetal. Infelizmente, tais curvas totais PV não têm sido amplamente relatado na rato, apesar do fato de que eles podem fornecer informações úteis sobre o macroscOPIC efeitos de mudanças estruturais no pulmão. Embora curvas PV parciais para avaliar apenas as variações no volume do pulmão são, por vezes relatados, sem uma medida de volume absoluto, a natureza não-linear da curva total PV faz com que essas parciais muito difícil de interpretar. No presente estudo, descrevemos uma maneira padronizada para medir a curva total PV. Estamos, então, testaram a capacidade dessas curvas para detectar mudanças na estrutura do pulmão do rato em duas patologias pulmonares comum, enfisema e fibrose. Os resultados mostraram alterações significativas em diversas variáveis ​​consistentes com as mudanças estruturais esperadas com estas patologias. Esta medição da curva de PV de pulmão em ratinhos proporciona assim um meio simples para controlar a progressão das alterações fisiopatológicas ao longo do tempo e o efeito potencial de procedimentos terapêuticos.

Introdução

O rato é agora o modelo animal primária de uma variedade de doenças pulmonares. Em modelos de enfisema ou fibrose, as alterações fenotípicas essenciais são melhor avaliadas medindo as alterações na elasticidade do pulmão. Embora existam muitas maneiras de medir a elasticidade, o método clássico é que a curva de pressão-volume total (PV) medido a partir do volume residual (VR) a capacidade pulmonar total (CPT). Essa medição foi feita no pulmão adulto de quase todas as espécies de mamíferos que remonta quase 100 anos ^1-3. Tais curvas PV também desempenhou um papel importante na descoberta e compreensão da função do surfactante pulmonar em desenvolvimento pulmonar fetal ^4-7. Apesar de a importância da curva de PV como uma medição do fenótipo do pulmão, não houve nenhuma maneira padronizada de efectuar esta medição. Foi feito simplesmente inflar e desinflar o pulmão com passos discretos (esperando um tempo variável de equilíbrio após cada) ou com bombas quepode continuamente inflar e desinflar o pulmão. A curva PV é feito muitas vezes ao longo de um intervalo de volume entre zero e alguma capacidade pulmonar definir pelo usuário, mas o tempo de duração de cada ciclo de volume pressão relatada por diferentes laboratórios tem sido extremamente variável, variando de alguns segundos ^{de 8} a ² hr. Alguns pesquisadores se referem a esta curva PV pulmonar total como estático ou quasiestático, mas estes são termos qualitativos que oferecem pouco de visão, e eles não são utilizados aqui. Além disso, a curva de PV não tem sido amplamente relatado no ratinho, apesar do facto de que pode fornecer informação útil sobre os efeitos de alterações estruturais macroscópicos nos pulmões.

Várias questões resultaram em variabilidade na aquisição da curva PV incluindo: 1) a taxa de inflação e deflação; 2) as excursões de pressão para a inflação e deflação; e 3) os meios para determinar uma medida absoluta do volume pulmonar. No método aqui presente, uma taxa de 3 ml / min foi escolhido como um compromise, não sendo demasiado curto para refletir a elasticidade dinâmica associada à ventilação normal e não é demasiado lenta para fazer a medição impraticável, particularmente quando se estuda grandes grupos. Uma vez que uma capacidade pulmonar total nominal em um / 6 rato saudável C57BL é da ordem de 1,2 ml ^9, esta taxa normalmente permite que dois completo fechado PV loops para ser feito em cerca de 1,5 min.

Na literatura extensas onde as curvas PV foram relatados, a pressão de enchimento pico utilizado tem sido extremamente variável, variando de tão baixo como 20 a mais de 40 cm de H ₂ O. Parte dessa variabilidade pode estar relacionada à espécie, mas o objetivo principal de estabelecer o limite de pressão superior para curvas PV é inflar o pulmão a capacidade pulmonar total (CPT), ou volume pulmonar máxima. A TLC em seres humanos é definida pelo esforço voluntária máxima de um indivíduo pode fazer, mas, infelizmente, esta nunca poderá ser duplicada em qualquer modelo animal. Assim, o volume máximo em curvas PV experimentais é dissuadirminado por uma pressão máxima arbitrariamente definida pelo investigador. O objectivo é estabelecer uma pressão onde a curva PV é plana, mas, infelizmente, o membro de inflação de uma curva PV pulmão de mamífero é nunca plana. Assim, a maioria dos investigadores definir uma pressão onde a curva começa a inflação para achatar substancialmente, tipicamente de 30 cm H ₂ O. No rato, no entanto, a curva PV é ainda mais complexo, com uma corcunda dupla no membro inflação, e onde esta parte da inflação é muitas vezes continua a aumentar acentuadamente a 30 cm H ₂ O ^10, portanto 30 não é um bom ponto final para a curva PV. Por esta razão, é utilizado 35 centímetros _H2O como o limite da pressão para a curva de rato PV, que é uma pressão à qual os membros de enchimento de todas as estirpes que examinamos começam a achatar.

Uma vez que a própria curva PV é muito linear, o aparecimento de um loop PV irá depender do volume a partir de onde a curva começa. Alguns ventiladores comerciais permitem que os usuários façam grandes laços PV, a partir de FRC, mas se o volume da FRC é desconhecido, então é possível interpretar tais mudanças na curva de PV com qualquer patologia, uma vez que essas modificações podem simplesmente resultar de uma alteração no volume de partida, e não alterações estruturais no pulmão. Assim, sem uma medição de volume absoluto, curvas PV são quase impossíveis de interpretar e, portanto, têm pouca utilidade. Apesar de, há várias maneiras de medir volumes pulmonares, estes são muitas vezes complicado e requer equipamento especial. Na abordagem simples descrita aqui, a curva PV começa no volume zero após um processo de desgaseificação in vivo.

Em resumo, este trabalho demonstra um método simples para padronizar medição curva PV de pulmão no pulmão do rato, e define várias métricas que podem ser calculados a partir da curva que estão ligados à estrutura do pulmão. A curva PV, portanto, fornece um teste de função pulmonar, que tem aplicação direta em ser capaz de detectar mudanças estruturais fenotípicas em camundongos com commem patologias pulmonares como enfisema e fibrose.

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Protocolo

O Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins aprovado todos os protocolos de animais.

1. Equipamentos

O sistema composto definido acima, pronta para medir a curva de PV é mostrado na Figura 1.

1. Medição de volume:
   1. Gerar uma taxa constante de inflação e deflação, utilizando uma bomba de seringa com um interruptor que permite que o usuário para reverter rapidamente a bomba depois de atingir os limites de pressão. Para as curvas do mouse PV, use um muito levemente untada 5 ml seringa de vidro com o volume inicial (antes da inflação), fixado em 3 ml de ar. 3 ml é suficientemente grande para medir volumes em quase todas as curvas do mouse PV.
   2. Medir o volume entregue pela bomba anexando um transformador diferencial linear para o alojamento da bomba, com uma pequena haste do sensor ligado ao êmbolo da seringa movendo.
      Nota: Um meio empíricos para corrigir para a compressão de gás no sistema é descrito sob o cu PVsecção de gravação rve.
2. Medição de pressão:
   1. Usar um medidor de pressão barato padrão com um intervalo de 0-60 cm de H ₂ O (0-1 psi).
3. Gravação de medição:
   1. Para gravar a curva PV usar qualquer gravador digital com recursos de XY (por exemplo, PowerLab). Defina um canal para gravar o sinal de volume corrigido e outro canal para registrar a pressão transpulmonar (PTP), a fim de elaborar o gráfico da curva PV. Usar um pré-amplificador de ponte que liga ao Powerlab principal para medir a pressão. Calibrar o canal de pressão 0-40 cm H ₂ O, e calibrar o canal de volume de 0-3 ml.

2. Correção de Compressão de Gás

Nota: Este é um passo inicial importante na configuração, uma vez que como a pressão aumenta, a diminuição do volume de gás, e, assim, o volume de ar fornecido para o rato irá ser cada vez menor do que o deslocamento do syrInge barril.

1. Fechar a torneira que vai ligar o sistema de PV para os pulmões, para que o gás não possa deixar o sistema. Iniciar a infusão e observar se o canal Volume corrigido no gravador mostra todas as mudanças mensuráveis, como a pressão aumenta para cerca de 40 cm H ₂ O. Se assim for, então correcta como nos passos seguintes.
   1. Correto para compressão de gás empiricamente subtraindo a partir da medição de deslocamento êmbolo (ou seja, o volume não corrigido) um termo proporcional à pressão de inflação. Faça isso em um canal Powerlab (chamado Vc) para mostrar o sinal de volume, menos um coeficiente vezes a pressão.
   2. Determine o coeficiente na equação. Primeiro, faça uma estimativa inicial, vire o registro gráfico, e ligar a bomba. Uma vez que o tubo de inflação é selada, ajustar o coeficiente multiplicador de pressão para fazer o canal Vc ler zero como a pressão aumenta, 0-40 cm de H ₂ O. Se ele vai para cima ou para baixo, basta ajustar o fator de correção até quepermanece estável ao longo da faixa de pressão. Este factor de correcção será sempre o mesmo, se as mesmas a partir de 3 ml de volume na seringa não é alterado.

3. testes experimentais em camundongos

1. Processo para a medição da curva de PV em ratinhos. Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Johns Hopkins University Animal Care e Use.
   1. Anestesiar ratos (C57BL / 6 ratos às 6-12 semanas de idade) com cetamina (90 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg), e confirmar a anestesia pela ausência do reflexo do movimento.
      Nota: A curva PV pode ser completada em ratos anestesiados, em menos de 10 min e é um procedimento terminal.
   2. Tracheostomize os ratos com uma agulha 18 G stub cânula. Fazer isso através de uma pequena incisão na pele que recobre a traqueia, localizando a traqueia, em seguida, fazendo um pequeno corte na traqueia, onde o topo da agulha pode ser inserida. Fixe a cânula, amarrando com rosca.
   3. Permitir que os ratos para respiração 100% de oxigênio para, pelo menos, 4 min. Isso pode ser feito através de respiração espontânea de um saco ou com um ventilador nominalmente definido com um volume corrente de 0,2 ml a 150 ciclos / min.
   4. Fechar a cânula traqueal e permitir 3-4 min para o rato para absorver todo o oxigénio. Este procedimento de absorção de oxigénio resulta a morte dos animais e de uma desgaseificação quase completa do pulmão ^11. Confirme morte do rato através da medição da cessação dos batimentos cardíacos com eletrodos de ECG ou observação direta.
   5. Uma vez que a desgaseificação do pulmão está completa e o volume do pulmão é zero, começar inflar os pulmões com ar ambiente na bomba de seringa a uma taxa de 3 ml / min. Monitorar o traçado da pressão sobre o gravador digital, e quando chega a 35 cm de H ₂ O, inverter a bomba.
   6. Siga a curva de deflação até que a pressão atinge negativa de 10 cm H ₂ O, época em que as vias aéreas entraram em colapso, prendendo o ar nos alvéolos que impedem uma maior redução de volume. Reverter imediatamente tele bombear novamente, permitindo que o pulmão de reinsuflação como as vias aéreas colapsadas abrir. Esta abertura heterogénea é normalmente aparente pelo membro inflação barulhento olhando para a parte inicial desta segunda inflação.
   7. Quando a pressão novamente chega a 35 cm H ₂ O, inverter a direção da bomba, e continuar a desinflar o pulmão até esta segunda parte deflação chega a 0 cm H ₂ O. Em seguida, parar a bomba.
   8. Veja o registro gráfico PowerLab de pressão e fluxo ea curva PV. Em seguida, analisar a curva PV para detectar alterações fenotípicas em parênquima pulmonar que ocorrem com diferentes patologias pulmonares.

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Resultados

Embora o procedimento para as curvas PV é demonstrado no vídeo apenas para controlo de ratos saudáveis, foi examinada a capacidade da curva PV para detectar alterações funcionais e patológicos em ratinhos com duas patologias comuns diferentes, enfisema e fibrose. Os detalhes destes modelos tradicionais descrito em outros lugares ^12,13. Muito brevemente, após anestesia com isoflurano a 3% foi enfisema causado por 3 ou 6 L elastase pancreática porcina instilado na traqueia e estudou 3 semanas mais tarde...

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Discussão

Neste papel um método reprodutível simples tem sido descrito para medir em ratinhos um método clássico de fenotipagem elasticidade pulmonar, a curva total PV pulmão. Essas curvas foram fundamentais para a descoberta de surfactante pulmonar e sua importância no fornecimento de estabilidade de pulmão. Aqui mostra-se como a curva PV também é útil ao proporcionar um meio para medir diversas variáveis ​​relacionadas com a elasticidade pulmonar no pulmão adulto do mouse. Houve mudanças muito significativas em...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syringe pump	Harvard Apparatus	55-2226	Infuse/withdraw syringe pump
Pump 22 reversing switch	Harvard Apparatus	552217	Included with pump
Linear displacement transformer	Trans-Tek, Inc.	0244-0000
5 ml glass syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Digital recorder	ADInstruments	PL3504	Several other possible vendors
Bridge amp signal conditioner	ADInstruments	FE221
Gas tank, 100% oxygen	Airgas, Inc		Any supplier or hospital source will work
Pressure transducer: 0 - 1 psi mV output	Omega Engineering	PX-137	Range ≈ 0 - 60 cm H2O