La mesure de la courbe pression-volume dans les poumons de souris

Résumé

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung’s structural changes with developing pathology.

Résumé

Au cours des dernières décennies, la souris est devenue le principal modèle animal d'une variété de maladies pulmonaires. Dans les modèles de l'emphysème ou de la fibrose, les changements phénotypiques essentielles sont mieux évaluées par la mesure des variations de l'élasticité des poumons. Pour comprendre mieux les mécanismes sous-jacents de telles pathologies spécifiques chez la souris, il est essentiel de faire des mesures fonctionnelles qui peuvent refléter la pathologie en développement. Bien qu'il existe de nombreuses façons de mesurer l'élasticité, le procédé classique est celle de la pression pulmonaire volume total (PV) courbe effectuée sur l'ensemble des volumes pulmonaires. Cette mesure a été effectuée sur les poumons adultes de presque toutes les espèces de mammifères datant de près de 100 ans, et ces courbes PV également joué un rôle majeur dans la découverte et la compréhension de la fonction du surfactant pulmonaire dans le développement des poumons du foetus. Malheureusement, ces courbes PV totaux ne ont pas été largement rapporté dans la souris, malgré le fait qu'ils ne peuvent fournir des informations utiles sur la macroscOPIC effets des changements structurels dans le poumon. Bien que les courbes PV partielles mesure seulement les changements de volume du poumon sont parfois signalés, sans une mesure de volume absolu, la nature non linéaire de la courbe de PV totale rend ces ceux partielles très difficile à interpréter. Dans la présente étude, nous décrivons une méthode normalisée pour mesurer la courbe de PV totale. Nous avons ensuite testé la capacité de ces courbes pour détecter des changements dans la structure du poumon de la souris dans deux pathologies pulmonaires commun, l'emphysème et la fibrose. Les résultats ont montré des changements significatifs dans plusieurs variables compatibles avec attendus des changements structurels avec ces pathologies. Cette mesure de la courbe du poumon chez les souris PV fournit ainsi un moyen simple de suivre la progression des changements physiopathologiques dans le temps et l'effet potentiel des procédures thérapeutiques.

Introduction

La souris est actuellement le principal modèle animal d'une variété de maladies pulmonaires. Dans les modèles de l'emphysème ou de la fibrose, les changements phénotypiques essentielles sont mieux évaluées en mesurant les variations de l'élasticité des poumons. Bien qu'il existe de nombreuses façons de mesurer l'élasticité, le procédé classique est celle de la courbe pression-volume total (PV) mesuré à partir du volume résiduel (VR) à la capacité pulmonaire totale (CPT). Cette mesure a été effectuée sur les poumons adultes de presque toutes les espèces de mammifères datant de près de 100 ans ^1-3. Ces courbes PV ont également joué un rôle majeur dans la découverte et la compréhension de la fonction du surfactant pulmonaire dans le développement des poumons du foetus ^4-7. Malgré l'importance de la courbe de PV comme une mesure de le phénotype du poumon, il n'y a pas de manière standardisée pour effectuer cette mesure. Cela a été fait par simple gonflage et dégonflage du poumon à pas discrets (en attente d'un temps variable pour atteindre l'équilibre après chaque) ou avec des pompes quepeut constamment gonfler et dégonfler le poumon. La courbe PV est souvent fait sur ​​une plage de volume comprise entre zéro et une certaine capacité pulmonaire définir par l'utilisateur, mais la durée de temps de chaque boucle de volume de pression rapportés par différents laboratoires ont été extrêmement variables, allant de quelques secondes ⁸ à h ^2. Certains chercheurs se réfèrent à cette courbe totale poumon PV comme statique ou quasi statique, mais ce sont des termes qualitatifs qui offrent peu de perspicacité, et ils ne sont pas utilisés ici. En outre, la courbe PV n'a pas été largement rapportés dans la souris, en dépit du fait qu'elle peut fournir des informations utiles sur les effets macroscopiques de changements structurels dans le poumon.

Plusieurs questions ont donné lieu à la variabilité dans l'acquisition de la courbe PV, y compris: 1) le taux d'inflation et de déflation; 2) les fluctuations de la pression de l'inflation et de déflation; et 3) les moyens pour déterminer une mesure du volume pulmonaire absolue. Dans le procédé présent ici, un taux de 3 ml / min a été choisi comme compromise, ne étant pas trop court à refléter l'élasticité dynamique associée à une ventilation normale et pas trop lente pour rendre la mesure impraticable, en particulier lors de l'étude de grandes cohortes. Depuis une capacité pulmonaire totale nominale dans une souris C57BL / 6 en bonne santé est de l'ordre de 1,2 ml ^9, ce taux permet généralement de deux complète fermé PV boucles à faire dans environ 1,5 min.

Dans la littérature étendue où les courbes PV ont été signalés, la pression de gonflage de pointe utilisée a été extrêmement variables, allant d'aussi peu que 20 à plus de 40 cm H ₂ O. Une partie de cette variabilité peut être liée à des espèces, mais un des principaux objectifs de réglage de la limite de pression supérieure pour les courbes PV est de gonfler les poumons à la capacité pulmonaire totale (CPT), ou le volume pulmonaire maximale. Le CCM chez l'homme est défini par l'effort volontaire maximale qu'un individu peut faire, mais malheureusement, ce ne peut jamais être dupliqué dans ne importe quel modèle animal. Ainsi, le volume maximal des courbes expérimentales PV est dissuaderminée par une pression maximale fixée arbitrairement par l'enquêteur. L'objectif est de mettre une pression où la courbe de PV est plat, mais malheureusement, le membre de l'inflation d'une courbe poumon PV mammifère ne est jamais plat. Donc, la plupart des chercheurs mis une pression où la courbe de l'inflation commence à se aplatir sensiblement, généralement 30 cm H ₂ O. Chez la souris, cependant, la courbe de PV est encore plus complexe avec une double bosse sur la branche de l'inflation, et où cette inflation membre est souvent encore en forte augmentation à 30 cm H ₂ O ^10, donc 30 ne est pas un bon point pour la fin courbe de PV. Pour cette raison, on utilise 35 cm H ₂ O en tant que la limite de pression pour la courbe PV souris, qui est une pression à laquelle les membres de gonflage de toutes les souches que nous avons examinés commencent à se aplatir.

Puisque la courbe PV lui-même est très non linéaire, l'apparition d'une boucle de PV dépendent du volume de l'endroit où la courbe commence. Certains ventilateurs commerciaux permettent aux utilisateurs de faire de grandes boucles PV, à partir de FRC, mais si le volume FRC est inconnu, alors il est impossible à interpréter comme des changements dans la courbe PV avec toute pathologie, puisque ces changements pourraient simplement résulter d'un changement dans le volume de départ, et non pas des modifications structurelles dans le poumon. Ainsi, sans une mesure de volume absolu, les courbes de PV sont presque impossibles à interpréter et ont donc peu d'utilité. Bien que, il ya plusieurs façons de mesurer le volume des poumons, ce sont souvent lourdes et nécessitent des équipements spéciaux. Dans l'approche simple décrite ici, la courbe PV commence à zéro volume après une vivo procédure de dégazage.

En résumé, ce document montre une méthode simple de normaliser poumon PV mesure de la courbe dans le poumon de la souris, et définit plusieurs mesures qui peuvent être calculées à partir de cette courbe qui sont liés à la structure du poumon. La courbe de PV fournit donc un test de la fonction pulmonaire qui a une application directe dans étant capable de détecter des changements structurels phénotypiques chez la souris avec commsur les pathologies pulmonaires telles que l'emphysème et la fibrose.

Protocole

Le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins a approuvé tous les protocoles d'animaux.

1. Équipement

Le système composite mis en place, prêt à mesurer la courbe de PV est illustrée à la figure 1.

1. Mesure de volume:
   1. Générer un taux constant de gonflage et de dégonflage en utilisant une pompe à seringue avec un commutateur qui permet à l'utilisateur d'inverser rapidement la pompe après avoir atteint les limites de pression. Pour les courbes souris PV, utiliser une seringue de 5 ml en verre très légèrement graissée avec le volume initial (avant inflation) fixé à 3 ml d'air. 3 ml est suffisamment grande pour mesurer les volumes dans presque toutes les courbes souris PV.
   2. Mesurer le volume refoulé par la pompe par la fixation d'un transformateur différentiel linéaire au boîtier de pompe, avec une tige de petit capteur relié au piston de la seringue en mouvement.
      REMARQUE: Un des moyens empiriques pour corriger la compression de gaz dans le système sont décrits dans le cu PVsection d'enregistrement de rve.
2. Mesure de pression:
   1. Utilisez une jauge de pression peu coûteux standard avec une gamme de 0-60 cm H ₂ O (0-1 PSI).
3. Enregistrement mesure:
   1. Pour enregistrer la courbe PV utiliser ne importe quel enregistreur numérique avec des capacités XY (par exemple, PowerLab). Régler un canal pour enregistrer le signal de volume corrigé et un autre canal pour enregistrer la pression transpulmonaire (PTP), afin de représenter graphiquement la courbe PV. Utiliser un préamplificateur de pont qui relie à la Powerlab principal pour mesurer la pression. Calibrer le canal de pression de 0 à 40 cm H ₂ O, et calibrer le volume du canal 0-3 ml.

2. Correction pour la compression du gaz

Remarque: Ce est une première étape critique dans la mise en place, depuis que la pression augmente, les baisses de volume de gaz, et donc le volume d'air délivré à la souris sera de moins en moins que le déplacement de la syrInge baril.

1. Fermer le robinet qui reliera le système de PV aux poumons, donc pas de gaz peut quitter le système. Lancer la perfusion et observer si le canal de volume corrigé sur l'enregistreur montre des changements mesurables que la pression augmente à environ 40 cm H ₂ O. Si oui, alors que correcte dans les prochaines étapes.
   1. Corriger pour la compression du gaz de manière empirique en soustrayant de la mesure piston de déplacement (ce est à dire, le volume non corrigé) d'un terme proportionnel à la pression de gonflage. Pour ce faire, sur un canal de Powerlab (appelée Vc) pour afficher le signal de volume moins une fois et coefficient de la pression.
   2. Déterminer le coefficient dans l'équation. Tout d'abord, faire une estimation initiale, tournez le tableau enregistrement sur et démarrer la pompe. Depuis le tube de l'inflation est scellé, régler le coefficient multiplicateur de pression pour faire le canal VC Lire zéro la pression monte de 0 à 40 cm H ₂ O. Se il monte ou descend, il suffit de régler le facteur de correction jusqu'à ce qu'ilreste à plat sur cette plage de pression. Ce facteur de correction est toujours la même, si les mêmes 3 ml à partir du volume dans la seringue ne est pas modifiée.

3. essais expérimentaux chez la souris

1. Procédure pour la mesure de la courbe PV chez la souris. Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins.
   1. Anesthésier la souris (C57BL / 6 à 6-12 semaines d'âge) avec la kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (15 mg / kg), et de confirmer l'anesthésie par l'absence de mouvement réflexe.
      Remarque: La courbe de PV peut être complété en souris anesthésiées en moins de 10 min et est une procédure terminal.
   2. Tracheostomize la souris avec une aiguille 18 G de stub canule. Pour ce faire, en faisant une petite incision dans la peau recouvrant la trachée, la localisation de la trachée, puis en faisant une petite fente dans la trachée, où l'aiguille de talon peut être inséré. Fixez la canule en attachant avec un fil.
   3. Autoriser les souris de respirer une00% d'oxygène pendant au moins 4 minutes. Cela peut être par l'intermédiaire de la respiration spontanée d'un sac ou d'un ventilateur fixé nominalement avec un volume courant de 0,2 ml à 150 respirations / min.
   4. Fermez la canule trachéale et permettre 3-4 min pour la souris pour absorber tout l'oxygène. Cette procédure d'absorption d'oxygène résulte de la mort des animaux et dans un dégazage à peu près complet de la ¹¹ poumon. Confirmation du décès de la souris par la mesure de la cessation du rythme cardiaque avec des électrodes d'ECG ou une observation directe.
   5. Une fois le dégazage du poumon est terminée et le volume pulmonaire est nulle, commencer à gonfler les poumons avec de l'air de la chambre de la pompe à seringue à un débit de 3 ml / min. Surveiller la trace de pression sur l'enregistreur numérique, et quand il atteint 35 cm H ₂ O, inverser la pompe.
   6. Suivez la courbe de la déflation que la pression atteint 10 cm H ₂ O négatif, époque à laquelle les voies aériennes se sont effondrés, emprisonner de l'air dans les alvéoles prévenir toute nouvelle réduction du volume. Annuler immédiatement til pompe à nouveau, permettant le poumon pour regonfler les voies respiratoires effondrés ouvrir. Cette ouverture est normalement hétérogène apparente par la bruyante regardant membre de l'inflation à la première partie de cette 2e inflation.
   7. Lorsque la pression atteint de nouveau 35 cm H ₂ O, inverser le sens de la pompe, et de continuer à dégonfler le poumon jusqu'à ce que cette 2ème branche de la déflation atteint 0 cm H ₂ O. Puis arrêter la pompe.
   8. Voir le dossier de tableau PowerLab de pression et le débit et la courbe de PV. Puis d'analyser la courbe de PV pour détecter les changements phénotypiques dans le parenchyme pulmonaire qui se produisent avec différentes pathologies pulmonaires.

Résultats

Bien que la procédure pour les courbes PV est démontré dans la vidéo que pour les souris saines de contrôle, nous avons examiné la capacité de la courbe PV pour détecter des changements fonctionnels et pathologiques chez des souris avec deux différentes pathologies courantes, l'emphysème et la fibrose. Les détails de ces modèles traditionnels décrits ailleurs ^12,13. Très brièvement, après anesthésie avec de l'isoflurane à 3% du emphysème a été causée par 3 ou 6 U élastase pancr?...

Discussion

Dans cet article, une méthode reproductible simple a été décrit pour mesurer chez la souris une méthode classique d'élasticité phénotypage du poumon, la courbe totale poumon PV. Ces courbes ont contribué à la découverte de surfactant pulmonaire et de son importance pour assurer la stabilité du poumon. Ici, il est montré comment la courbe PV est également utile pour fournir un moyen de mesurer plusieurs variables liées à l'élasticité pulmonaire dans les poumons de souris adultes. Il y avait des ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Syringe Pump	Harvard Apparatus	55-2226	Infuse/Withdraw syringe pump
Pump 22 Reversing Switch	Harvard Apparatus	552217	included with pump
Linear displacement transformer	Trans-Tek, Inc.	0244-0000
5 mL glass syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Digital recorder	ADInstruments	PL3504	Several other possible vendors
Bridge Amp Signal Conditioner	ADInstruments	FE221
Gas tank,100% oxygen	Airgas, Inc		Any supplier or hospital source will work
Pressure Transducer - 0-1psi  millivolt output	Omega Engineering	PX-137	Range: ≈0-60 cmH2O