从人类母胎界面分离白细胞

摘要

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

摘要

怀孕的特点是在生殖组织，并在母胎界面白细胞（底蜕膜及蜕膜顶叶）的渗透。此接口是母体和胎儿组织之间的接触解剖位置;因此，它是作用在怀孕期间免疫位点。白细胞浸润在母胎界面起到交付的植入了核心作用，维护妊娠和时序。因此，这些白细胞的表型和功能性的刻画将提供洞察导致怀孕紊乱的机制。有几个协议，以隔离从蜕膜和蜕膜顶叶白细胞浸润了说明;然而，由于缺乏在试剂，酶和孵化的时间一致性使得难以比较这些结果。本文描述的是一种新的方法，结合使用温和的机械和酶迪斯引产技术，以保护细胞外和细胞内标志物的可行性和完整性白细胞从在母胎界面的人体组织中分离。除了免疫，细胞培养和细胞分选，这个协议的未来的应用是多种多样的。按照此协议，分离的白细胞可用于确定DNA甲基化，靶基因的表达， 在体外白细胞功能（ 即 ，吞噬作用，细胞毒性，T细胞增殖，和可塑性， 等 ），以及生产的活性氧在母胎界面。此外，使用所描述的协议，该实验室已经能够描述新和罕见的白细胞在母胎界面。

引言

怀孕的特征在于三种不同的免疫学阶段:1）植入并用促炎症反应相关的早期胎盘（ 即 ，植入类似于一个"开放性伤口"）; 2）孕中期和孕大部分的孕晚期时免疫稳态通过主要是消炎的状态在母胎界面实现; 3）分娩，促炎症状态^1-7。免疫细胞在母胎界面发挥在炎症反应的调节中起重要作用，他们的丰度和在整个孕期^6-9本土化的改变。

在人类中，母胎界面代表了母性（蜕膜）和胎儿（绒毛膜滋养层或）组织之间的直接接触面积。该接口包括:1）蜕膜顶叶的行宫腔未包括的胎盘和是并列以绒毛膜绒毛的;和2）的底蜕膜，位于它是由间质滋养层^10（ 图1）侵入胎盘的基板。接触的这些区域的亲密创建胎儿抗原暴露于母体免疫系统^11-13的条件。不足为奇的是，白细胞包括多达蜕膜细胞^8,9,14,15 30-40％除了典型的基质型细胞和腺细胞^8,14,16。白细胞在母胎界面的作用涵盖了包括滋养细胞浸润¹⁷的限制，螺旋动脉^18,19的重塑，维护产妇宽容^12,20和劳动力^21-26启动多个进程。两者的适应性和免疫系统， 即 ，T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，B细胞，树突细胞，和NK细胞，已在蜕膜组织确定了先天四肢，以及它们的白细胞比例和激活状态已示出，以改变空间和时间整个妊娠期^{6-10,12,14,24,27-30。}在白细胞种群和/或功能的扰动与自然流产^31，先兆子痫^32，宫内生长受限^32,33，和早产^7,24相关联。因此，在人类母胎界面的表型特征和白细胞功能的研究将有助于失调在怀孕紊乱的免疫途径的阐明。

一种用于确定表型和白细胞的功能特性被流式细胞术的最有力的工具，技术，允许多个参数同时^34-36的定量分析。分析白细胞通过流式细胞术，在单细胞悬浮液中的白细胞的隔离是必需的。因此，一个方法来分离浸润亮氨酸从母胎界面kocytes是需要研究其表型和功能特性。

几种方法已经被描述，从人类母胎界面^{10,14,25,27,37-39}隔离白细胞。虽然一些应用机械分解^{10,25,27,38，}别人用酶消化^37,40进行组织分离。因为机械解聚产生较低产量和降低的生存力^41，和酶解可影响生存力和细胞表面标记物保留^42，本文所描述的方法结合温和机械解离与酶预处理，以增加分离的白细胞的产量而不影响细胞生存力。方法类似的组合已经被证明是有效的，从在母胎界面³⁹蜕膜组织白细胞的隔离。因此，本文描述的协议涉及机甲nical分解与自动组织离解，增加一致性，同时节省时间和劳动时与反对手术刀，刀片，或手术剪^10,28比传统的切碎。选择用于组织解离酶是的Accutase。不同于常用的胶原酶^43，分散酶^44，和胰蛋白酶⁴⁵的Accutase（细胞分离液）结合了一般的蛋白和有助于高效而温和的解离^46,47胶原溶解活动。解离后，将白细胞从蜕膜细胞通过密度梯度离心的总人口富集。各种密度梯度介质先前已经利用，其中最常见的是珀（胶体二氧化硅粒子的悬浮液^）48和聚蔗糖（蔗糖的具有高合成分子量的聚合物^）49。隔离的蔗糖聚合物的卓越效率一直previously所示^50，和本文中进一步描述的方案证明该密度梯度介质能产生单核白细胞的足够高的纯度。

因此，本文描述的协议相结合的机械组织分解用自动组织离解，酶消化用细胞分离溶液，并用密度梯度介质（1.077 + 0.001g /每毫升）以分离从人蜕膜白细胞白细胞的分离。该协议已经被证明维持细胞表面抗原连同细胞活力。分离的白细胞可用于多种应用，包括免疫流式细胞仪和体外功能研究。

研究方案

该协议适用于由底蜕膜及蜕膜在顶叶准备免疫流式细胞仪检测白细胞隔离。此外，可用于细胞分选，细胞培养，RNA分离和细胞学分离的细胞。与之前在此协议中提到的样品的工作，人类伦理委员会批准，必须从本地研究伦理委员会和伦理审查委员会获得的。收集和利用人力样本用于研究目的的批准了儿童健康和人类发展（NICHD）的尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国立研究所的机构审查委员会，健康（NIH）全国学院，健康与人类服务部（DHHS ，贝塞斯达，MD，USA）和韦恩州立大学（底特律，MI，USA）。书面知情同意从所有孕妇之前组织样本的采集获得。
注意:当有动物血，细胞，或危险工作代理的OU中提到这个协议中，很重要的是正确的生物安全和实验室安全行动应遵循。

1.解剖人类蜕膜的

注:基板是下方并附着到胎盘底座和表示母体的表面。该chorioamniotic膜包括羊膜和绒毛膜。基底板包括蜕膜和绒毛膜包括蜕膜顶叶（ 图1）。

1. 底蜕膜
   1. 从胎盘（ 图1A和1B）中的一个子叶解剖一块基底板。
   2. 将其放在无菌砧板与朝上胎盘绒毛。侧面显示了胎盘绒毛通常是血淋淋的红色外观毛茸茸的组织。基底板是平滑和颜色淡红色。
   3. 用锋利，细点的剪刀和镊子除去VILLOU中组织和血管。保持浸泡在1×PBS中的组织的过程中（ 图1C）中（ ^钙 -自由-和Mg ^2+）。收集2-3这些片和用1×PBS彻底冲洗以除去血液（ 图1D）。
2. 蜕膜顶叶
   1. 解剖一块chorioamniotic膜（约10厘米×10厘米， 图1E）。将它放置在黑板上用绒毛膜朝上。绒毛膜侧包含血腥和血块通常是淡黄色的颜色。
   2. 用细点钳去除尽可能多的血块为可能的（ 图1E）。冲洗该膜在无菌的1×PBS清洗过量的血液从该膜，直至1×PBS中运行清楚。
   3. 使用一次性无菌细胞刮至轻轻刮去从膜的蜕膜层。应用无菌1X PBS的纪念品brane而完成这个过程（ 图1F）。收集蜕膜组织，并放置在50毫升的塑料管，用无菌1X PBS（ 图1G）。

2.机械解聚和酶消化

1. 在50ml塑料管中洗，用无菌的1×PBS从蜕膜（来自步骤1.1.3）解剖组织或蜕膜顶叶（来自步骤1.2.3）。通过离心收集组织粒料在300×g离心5分钟，在RT。
2. 吸位于高于组织沉淀上清小心而不会干扰沉淀。
   注意:在这一点上，该颗粒是非常宽松，因为它们包含红血球。如果粒料的体积为约或低于3毫升，再悬浮在6ml的细胞脱附溶液预加热至37℃沉淀。如果粒料比3毫升体积较大，增加更多的细胞脱离溶液（日增加约2倍Ë体积组织样本）。
3. 转移组织匀浆（底蜕膜+细胞分离液，或蜕膜+顶叶细胞分离液）为C管。
4. 代替C-管在自动离解器并运行相应的程序。
   注:该程序为底蜕膜运行17秒，共668发每运行。该程序为蜕膜运行顶叶为37秒，共235发每运行。这些方案已自定义为从底蜕膜或蜕膜与顶叶良好的收益率和细胞活力隔离白细胞。
5. 以下的组织的机械解聚，消化组织中的市售的细胞分离溶液如的Accutase;为45分钟，在37℃，轻轻摇动（包含蛋白水解和胶原溶解酶鸡尾酒）。

3.隔离白细胞

1. 孵育后，加入10 mL的1×PBS中的DIGEStion的混合物中，并通过100微米的细胞过滤将它传递到50ml塑料管中。取决于消化混合物的粘性，人们可能需要用几个细胞滤器一混合物。
2. 填充管用1×PBS和离心机在300×g离心5分钟，在RT。取出的1×PBS上述细胞沉淀小心和重新悬浮用5ml冰冷却的FACS缓冲液中的颗粒。
   注:要研究多形和单核白细胞在一起，则转到步骤6.1;研究单核白细胞，继续执行步骤3.3。
3. 加入5毫升20％的密度梯度介质（1.077 + 0.001g /每毫升），以15毫升的塑料管中并慢慢叠加在密度梯度介质的顶部的细胞悬浮液。而层叠的样品，它不与细胞悬浮液混合的密度梯度介质是重要的。
4. 离心用水平转子在500×g离心30分钟，在4℃不制动。关闭制动器，以避免混合细胞和L这是非常重要的osing梯度。白细胞将在密度梯度介质和FACS缓冲液之间的界面上找到。
5. 删除包含FACS缓冲液和细胞碎片非常仔细地用移液管上层。界面处的频带包含蜕膜单核细胞和多形核白细胞的一部分。
6. 完全转移的细胞在界面到一个新的15毫升塑料管。加的FACS缓冲液的至少3倍以上的体积。
7. 离心在300×g离心5分钟以造粒细胞。吸出上清液，并用FACS缓冲液洗细胞。造粒的细胞再次离心分离，在300×g离心5分钟，在RT。
   注:要执行的细胞培养，见第4步:为了进行细胞分选，见第5步:为了进行免疫，见第6步。

4.应用 - 细胞培养

1. 重悬在1ml的RPMI培养基1640的来自步骤3.7的细胞计数的存活细胞USI纳克自动细胞计数或血球和台盼蓝溶液0.4％。
2. 加起来的RPMI培养基的量，使1×10 ⁶个细胞/ ml的细胞浓度。细胞现在已经准备好了的文化。

5.应用程序 - 巨噬细胞分离的原代细胞培养

1. 以分离的CD14 +细胞，磁来自步骤3.7与CD14微珠（每10 ⁷个细胞20微升磁珠）标记细胞，孵育15分钟，在4℃，通过施加磁场单独的CD14 +细胞从其它类型的细胞。洗涤2次后用MACS缓冲液和除去磁场，洗脱磁力保留CD14 +细胞用MACS缓冲液。
2. 离心后，重新悬浮细胞沉淀在RPMI培养基1640中细胞准备用于电镀（ 图2）。

6.应用 - 免疫分型

1. 以使用该单元为immunophenotyping，在1ml的1×PBS再中止来自步骤3.7的细胞。计数使用自动细胞计数器或血球和台盼蓝溶液0.4％的活细胞。
2. 标记的细胞与可固定活力染料（ 图3）。用FACS缓冲液清洗细胞两次，并重新悬浮细胞在染色缓冲液中。孵育一个的FcR阻断剂为15分钟，在4℃。
3. 添加共轭荧光抗体外。例如，在这个协议中，使用抗CD3，抗CD19，抗CD14，抗CD15和抗CD56抗体（ 表1）。温育30分钟，在黑暗中4℃。
4. 洗涤2次后用1×PBS，细胞在500μl的染色缓冲液使用流式细胞仪进行分析。用于分析在蜕膜组织中发现的白细胞亚种群的门控策略的表示示于图4。

结果

。在母胎界面人类组织（底蜕膜及蜕膜顶叶）的解剖见图1此过程包括基板，其中包括底蜕膜（ 图1A - D）的清扫。通过除去从基板（图1C）的胎盘绒毛（胎侧）得到的蜕膜。蜕膜是顶叶轻轻刮绒毛膜（ 图1E - F）收集。 图2显示了孤立的巨噬细胞（CD14 +），从使用磁性细胞分选在足月妊娠蜕膜收集顶叶的形态。...

讨论

在人类母胎界面白细胞浸润的功能和表型特征的表征是必不可少的，导致妊娠疾病的免疫机制的理解。若干技术以分离从人母胎界面白细胞整个怀孕^{10,14,25,28,37,42,43}了描述。然而，每一个这些技术是截然不同的，使用不同的酶或酶组合，需要不同的解离时间，不指定组织的数量时，以及最重要的是，并不总是指定分离的细胞的生存力。本文所描述的协议允许浸润在人类母胎界面白细胞（蜕...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubes	Any vendor
50 ml conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 ml round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30 μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15 ml safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator