Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

Resumen

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Resumen

El embarazo se caracteriza por la infiltración de leucocitos en los tejidos reproductivos y en la interfase materno-fetal (decidua basal y decidua parietal). Esta interfaz es el lugar anatómico de contacto entre la madre y tejidos fetales; Por lo tanto, es un sitio de acción inmunológica durante el embarazo. Leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal juegan un papel central en la implantación, el mantenimiento del embarazo, y el momento de la entrega. Por lo tanto, caracterizaciones fenotípicas y funcionales de estos leucocitos proporcionarán información sobre los mecanismos que conducen a trastornos del embarazo. Varios protocolos se han descrito con el fin de aislar la infiltración de leucocitos de la decidua basal y decidua parietal; sin embargo, la falta de coherencia en los reactivos, enzimas, y los tiempos de incubación hace que sea difícil comparar estos resultados. Se describe aquí un nuevo enfoque que combina el uso de diss mecánicos y enzimáticos suavesociation técnicas para preservar la viabilidad e integridad de los marcadores extracelulares e intracelulares en los leucocitos aislados de los tejidos humanos en la interfase materno-fetal. Aparte de inmunofenotipo, cultivo celular, y la clasificación de células, las aplicaciones futuras de este protocolo son numerosas y variadas. Siguiendo este protocolo, los leucocitos aislados se pueden utilizar para determinar la metilación del ADN, la expresión de genes diana, en funcionalidad vitro de leucocitos (es decir, la fagocitosis, citotoxicidad, la proliferación de células T, y la plasticidad, etc.), y la producción de especies reactivas de oxígeno en la interfase materno-fetal. Además, utilizando el protocolo descrito, este laboratorio ha sido capaz de describir nuevos y raros leucocitos en la interfase materno-fetal.

Introducción

El embarazo se caracteriza por tres fases distintas inmunológicos: 1) la implantación y placentación temprana asociada con una respuesta pro-inflamatoria (es decir, la implantación se asemeja a una "herida abierta"); 2) el segundo trimestre y la mayor parte del tercer trimestre del embarazo cuando se logra la homeostasis inmune a través de un estado predominantemente anti-inflamatoria en la interfase materno-fetal; y 3) el parto, un estado pro-inflamatorio ^1-7. Las células inmunes juegan un papel importante en la regulación de la respuesta inflamatoria en la interfase materno-fetal, donde su abundancia y el cambio de localización durante todo el embarazo ^6-9.

En los seres humanos, la interfaz materno-fetal representa un área de contacto directo entre los tejidos materna (decidua) y fetal (corion o trofoblasto). Esta interfaz incluye: 1) la decidua parietal que recubre la cavidad uterina no cubierto por la placenta y es en yuxtaposiciónpara el corion leve; y 2) la decidua basal, que se encuentra en la placa basal de la placenta donde es invadida por los trofoblastos intersticiales ¹⁰ (Figura 1). La intimidad de estas zonas de contacto crea condiciones para la exposición antigénica fetal al ^11-13 materna sistema inmunológico. No es sorprendente, los leucocitos comprenden hasta el 30-40% de las células deciduales ^8,9,14,15 además de las células de tipo estromal típicos y células glandulares ^8,14,16. El papel de los leucocitos en la interfase materno-fetal abarca múltiples procesos que incluyen la limitación de la invasión trofoblástica ^17, la remodelación de las arterias espirales ^18,19, el mantenimiento de la tolerancia materna ^12,20, y el inicio del trabajo ^21-26. Los leucocitos tanto de la adaptación y las extremidades innata del sistema inmune, es decir, las células T, macrófagos, neutrófilos, células B, células dendríticas, y células NK, se han identificado en los tejidos deciduales, y suproporciones y estado de activación se ha demostrado que variar espacialmente y temporalmente durante toda la gestación ^{6-10,12,14,24,27-30.} Las perturbaciones en la población y / o la función de leucocitos están asociados con el aborto espontáneo ^{31, 32} preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino ^32,33, y trabajo de parto prematuro ^7,24. Por lo tanto, el estudio de las características fenotípicas y la funcionalidad de los leucocitos en la interfase materno-fetal humano facilitará la elucidación de las vías inmunológicas dysregulated en los trastornos del embarazo.

Una de las herramientas más poderosas utilizadas para determinar el fenotipo y las propiedades funcionales de los leucocitos se citometría de flujo, la tecnología que permite el análisis cuantitativo de múltiples parámetros simultáneamente ^34-36. Para analizar los leucocitos por citometría de flujo, se requiere aislamiento de los leucocitos en una suspensión de una sola célula. Por lo tanto, un método para separar la infiltración leuSe necesita kocytes desde la interfaz materno-fetal para estudiar su fenotípica y propiedades funcionales.

Varios métodos han sido descritos para aislar los leucocitos desde la interfaz materno-fetal humano ^{10,14,25,27,37-39.} Mientras que algunos se aplican desagregación mecánica ^10,25,27,38, otros utilizan digestión enzimática ^37,40 para la disociación de tejido. Debido a la desagregación mecánica produce un menor rendimiento y reducción de la viabilidad ^41, y la disociación enzimática puede afectar a la viabilidad y la retención de marcador de superficie celular ^42, el método descrito en el presente documento combina la disociación mecánica suave con enzimático pre-tratamiento para aumentar el rendimiento de los leucocitos aislados sin comprometer la viabilidad celular. Una combinación similar de métodos ha demostrado ser eficaz en el aislamiento de leucocitos de los tejidos deciduales en la interfase materno-fetal ^39. Por lo tanto, el protocolo descrito en este documento implica mechadesagregación nica con un disociador tejido automático que aumenta la consistencia, mientras que el ahorro de tiempo y mano de obra en comparación con picado tradicional con escalpelos opuestas, hojas de afeitar o tijeras quirúrgicas ^10,28. La enzima seleccionada para la disociación del tejido era Accutase. A diferencia colagenasa utilizada ^43, Dispasa ^{44, 45} y tripsina, Accutase (una solución desprendimiento celular) combina proteolítica general y actividades colagenolíticas que contribuyen a la disociación eficiente pero suave ^46,47. Después de la disociación, los leucocitos se enriquecen a partir de la población total de las células deciduales por centrifugación en gradiente de densidad. Varios medios de gradiente de densidad se han utilizado previamente, el más común de los cuales son Percoll (una suspensión de partículas de sílice coloidal) y Ficoll ⁴⁸ (un polímero de sacarosa con un alto peso molecular sintético) ^49. La eficacia superior de aislamiento por el polímero sacarosa ha sido Previously muestra ^50, y el protocolo descrito en el presente documento además demuestra que este medio de gradiente de densidad produce una pureza suficientemente alta de los leucocitos mononucleares.

Por lo tanto, el protocolo descrito en el presente documento combina la desagregación tisular mecánico con un disociador automática tejido, la digestión enzimática con una solución de desprendimiento celular, y la separación de leucocitos con un medio de gradiente de densidad (1,077 + 0,001 g / ml) para aislar los leucocitos de tejidos deciduales humanos. Este protocolo se ha demostrado para preservar los antígenos de superficie celular, junto con la viabilidad celular. Los leucocitos aislados se pueden utilizar para múltiples aplicaciones que incluyen inmunofenotipo con citometría de flujo y estudios funcionales in vitro.

Protocolo

Este protocolo es apropiado para el aislamiento de leucocitos de la decidua basal y decidua parietal en preparación para inmunofenotipo por citometría de flujo. Además, las células aisladas se pueden utilizar para la clasificación de células, cultivo celular, el aislamiento de ARN, y la citología. Antes de trabajar con las muestras mencionadas en este protocolo, la aprobación ética humana debe ser obtenido de la Comisión de Ética Local Investigación y Juntas de Revisión Institucional. La recolección y utilización de muestras humanas para fines de investigación fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional del Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD), los Institutos Nacionales de Salud (NIH), Departamento de Salud y Servicios Humanos (DHHS , Bethesda, MD, EE.UU.) y la Universidad Estatal de Wayne (Detroit, MI, EE.UU.). Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todas las mujeres embarazadas antes de la recogida de muestras de tejido.
NOTA: Mientras trabajaba con la sangre de animales, células, o peligroagentes sas como se menciona en este protocolo, es esencial que la bioseguridad adecuada y medidas de seguridad de laboratorio seguir.

1. La disección de los tejidos deciduales Humanos

NOTA: La placa basal es la base debajo y unido a la placenta y representa la superficie materna. Las membranas corioamnióticas incluyen el amnios y el corion. La placa basal incluye la decidua basal y el corion incluye la decidua parietal (Figura 1).

1. Decidua Basalis
   1. Diseccionar una pieza de la placa basal a partir de un cotiledón de la placenta (Figuras 1A y 1B).
   2. Colóquelo sobre una tabla de cortar estéril con las vellosidades placentarias hacia arriba. El lateral que muestra las vellosidades de la placenta es generalmente de color rojo sangriento con el tejido peluda en apariencia. La placa basal es suave y rojo pálido en color.
   3. Utilice afilados, tijeras de punta fina y unas pinzas para quitar la villtejidos y los vasos sanguíneos sas. Mantenga el tejido empapado en 1x PBS (Ca ²⁺ - y Mg ^{2 +} - libre) durante el proceso (Figura 1C). Suma 2 a 3 de estas piezas y enjuague a fondo con 1x PBS para eliminar la sangre (Figura 1D).
2. Decidua parietal
   1. Diseccionar un pedazo de las membranas corioamnióticas (aproximadamente 10 cm x 10 cm, Figura 1E). Colóquelo en el tablero con el corion hacia arriba. El lado coriónica contiene coágulos sangrientos y suele ser la luz de color amarillento.
   2. Utilice unas pinzas de punta fina para eliminar la mayor cantidad de los coágulos de sangre como sea posible (Figura 1E). Enjuague la membrana en 1x PBS estéril para limpiar el exceso de sangre de la membrana hasta que el PBS 1x salga clara.
   3. Use un raspador celular estéril desechable para raspar suavemente la capa decidual de la membrana. Aplicar 1x PBS estéril en la membrana al completar este proceso (Figura 1F). Recoge los tejidos deciduales y colocarlos en un tubo de plástico de 50 ml con PBS 1x estéril (Figura 1G).

2. La desagregación mecánica y digestión enzimática

1. Lave el tejido diseccionado de la decidua basal (desde el paso 1.1.3) o la decidua parietal (del Paso 1.2.3) con 1x PBS estéril en un tubo de plástico de 50 ml. Recoger gránulos de tejidos por centrifugación a 300 xg durante 5 min a TA.
2. Aspirar el sobrenadante situado por encima del sedimento de tejido cuidadosamente sin perturbar el sedimento.
   NOTA: En este punto, los pellets son muy floja, ya que contienen las células rojas de la sangre. Si el volumen de la pastilla está relacionado o menos de 3 ml, vuelva a suspender el sedimento en 6 ml de solución de desprendimiento de células pre-calentado a 37 ° C. Si la pastilla es mayor que 3 ml de volumen, añadir más solución desprendimiento celular (añadir alrededor de 2 veces ªe volumen de las muestras de tejido).
3. Transferir los tejidos homogeneizados (decidua basal + desprendimiento de células de soluciones o decidua parietal + solución desprendimiento de células) a un tubo C.
4. Coloque el tubo de C en el disociador automática y ejecutar el programa correspondiente.
   NOTA: El programa de la decidua basal tiene una duración de 17 segundos con 668 rondas totales por corrida. El programa para la decidua parietal tiene una duración de 37 segundos con 235 rondas totales por corrida. Estos programas han sido diseñadas para aislar leucocitos de la decidua basal o la decidua parietal con buen rendimiento y la viabilidad celular.
5. Tras la desagregación mecánica de los tejidos, digerir los tejidos con una solución de desprendimiento celular comercialmente disponible tal como accutase; (Un cóctel que contiene enzimas proteolíticas y colagenolíticas) durante 45 min a 37 ° C con agitación suave.

3. Aislamiento de leucocitos

1. Después de la incubación, añadir 10 ml de PBS 1x a la digemezcla stion y pasarlo por un colador celular 100 micras en un tubo de plástico de 50 ml. Dependiendo de la viscosidad de la mezcla de digestión, se puede necesitar utilizar varios filtros de células para una mezcla.
2. Llenar el tubo con 1x PBS y centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA. Retire el PBS 1x por encima de los sedimentos celulares con cuidado y volver a suspender los pelets con 5 ml de tampón de FACS enfriado con hielo.
   NOTA: Para el estudio de los leucocitos polimorfonucleares y mononucleares juntos, ir al paso 6.1; para estudiar los leucocitos mononucleares, continúe con el Paso 3.3.
3. Añadir 5 ml de 20% de medios de gradiente de densidad (1,077 + 0,001 g / ml) a un tubo de plástico de 15 ml y superponer lentamente la suspensión celular en la parte superior de los medios de gradiente de densidad. Mientras capas de la muestra, es importante no mezclar los medios de gradiente de densidad con la suspensión de células.
4. Centrifugar con un rotor basculante a 500 xg durante 30 min a 4 ° C sin el freno. Es muy importante para desactivar el freno para evitar la mezcla de las células y lOsing el gradiente. Los leucocitos se encuentran en la interfaz entre los medios de gradiente de densidad y el tampón FACS.
5. Eliminar la capa superior que contiene el tampón y los desechos de células FACS muy cuidadosamente con una pipeta. La banda en la interfase contiene las células mononucleares de la decidua y una porción de los leucocitos polimorfonucleares.
6. Transferencia de las células en la interfaz completamente a un nuevo tubo de plástico de 15 ml. Añadir al menos 3 veces más volumen de tampón FACS.
7. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a peletizar las células. Aspirar el sobrenadante y lavar las células con tampón FACS. Peletizar las células con otra centrifugación a 300 xg durante 5 min a TA.
   NOTA: Para llevar a cabo el cultivo celular, consulte el Paso 4. Para llevar a cabo la clasificación de células, consulte el Paso 5. Para realizar inmunofenotipo, consulte el Paso 6.

4. Aplicaciones - Cultivo de células

1. Vuelva a suspender las células del paso 3.7 en 1 ml de medio de cultivo RPMI 1640. Cuenta las células viables using de un contador de células automático o un hemocitómetro y una solución de azul de tripano al 0,4%.
2. Añadir la cantidad de medio de cultivo RPMI para hacer una concentración celular de 1 x 10 ⁶ células / ml. Las células están listas para la cultura.

5. Aplicaciones - Aislamiento de macrófagos para la Cultura de la célula primaria

1. Para aislar las células CD14 +, magnéticamente marcar las células de la Etapa 3.7 con microperlas CD14 (20 l perlas por 10 ⁷ células), se incuba durante 15 min a 4 ° C, y las células CD14 + separado de otros tipos de células mediante la aplicación de un campo magnético. Después de 2 lavados con tampón MACS y la eliminación del campo magnético, eluir las células CD14 + retenidas magnéticamente con tampón MACS.
2. Después de la centrifugación, re-suspender los sedimentos celulares en medio de cultivo RPMI 1640. Las células están listos para el chapado (Figura 2).

6. Aplicaciones - inmunotipificación

1. Para utilizar las células para immunophenotyping, volver a suspender las células del paso 3.7 en 1 ml de PBS 1x. Contar las células viables usando un contador de células automático o un hemocitómetro y una solución de azul de tripano al 0,4%.
2. Etiqueta de las células con un colorante viabilidad corregible (Figura 3). Lavar las células dos veces con tampón FACS y volver a suspender las células en tampón de tinción. Incubar con un bloqueador FcR durante 15 min a 4 ° C.
3. Añadir anticuerpos conjugados con fluorocromos extracelulares. Por ejemplo, en este protocolo, utilizar anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15, anti-CD56 y anticuerpos (Tabla 1). Incubar durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad.
4. Después de 2 lavados con PBS 1x, se analizarán las células en 500 l de tampón de tinción utilizando un citómetro de flujo. Una representación de la estrategia de gating utilizado para analizar las subpoblaciones de leucocitos que se encuentran en los tejidos deciduales se muestra en la Figura 4.

Resultados

. La disección de los tejidos humanos en la interfase materno-fetal (decidua basal y decidua parietal) se muestra en la Figura 1 Este procedimiento incluye la disección de la placa basal, que incluye la decidua basal (Figura 1A - D). La decidua basal se obtiene mediante la eliminación de las vellosidades de la placenta (lado fetal) de la placa basal (Figura 1C). La decidua parietal se recoge raspando suavemente la membrana coriónica (Figura ...

Discusión

Caracterización de las propiedades funcionales y fenotípicas de la infiltración de leucocitos en la interfase materno-fetal humano es esencial para la comprensión de los mecanismos inmunológicos que conducen a trastornos del embarazo. Varias técnicas se han descrito con el fin de aislar los leucocitos de la interfaz materno-fetal durante el embarazo humano ^{10,14,25,28,37,42,43.} Sin embargo, cada una de estas técnicas es distinta, utiliza enzimas o combinaciones de enzimas diferentes, requiere diferente...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubes	Any vendor
50 ml conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 ml round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30 μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15 ml safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator