인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

요약

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

초록

임신은 생식 조직과 모성 - 태아 인터페이스에서 백혈구 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)의 침윤을 특징으로한다. 이 인터페이스는 산모와 태아 조직 사이의 접촉의 해부학 적 위치이다; 따라서, 임신 동안 작업의 면역 사이트이다. 산모 - 태아 인터페이스에서의 침투 백혈구는 전달의 중심 주입 역할, 임신의 유지 보수 및 타이밍을한다. 따라서 이러한 백혈구의 표현형 및 기능 특성화 임신 장애로 이어질 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 몇몇 프로토콜들은 탈락의 basalis 및 탈락의 parietalis로부터 백혈구 침윤 분리하기 위해 설명되었다; 그러나, 배양 시약, 효소, 및 시간에서의 일관성 결여 어려운 이들 결과를 비교한다. 본원에 기재된 부드러운 기계적 및 효소 DISS의 사용을 겸비한 신규 한 접근법ociation 기술 모체 - 태아의 계면에서의 인간 조직에서 분리 된 백혈구 세포 및 세포 마커의 생존과 무결성을 보존한다. 제외하고 모두 면역, 세포 배양, 세포 분류에서,이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 많고 다양하다. 이 프로토콜에 따라, 절연 백혈구 DNA를 시험 관내 백혈구 기능 (즉, 식세포 작용, 세포 독성 T 세포 증식 및 가소성 등)에 메틸화, 표적 유전자의 발현 및 활성 산소 종의 생성을 결정하는데 사용될 수있다 산모 - 태아 인터페이스에서. 또한, 설명 된 프로토콜을 사용하여,이 연구소는 산모 - 태아 인터페이스에서 새로운 희귀 백혈구를 설명 할 수있다.

서문

임신은 세 가지 면역 학적 상 특징 : 1) 주입 및 프로 - 염증 반응과 관련된 초기 태반이 (즉, 주입은 '열린 상처'과 유사) 2) 두 번째 임신과 면역 항상성이 산모 - 태아 인터페이스에서 주로 항 염증 상태를 통해 달성 임신의 세 번째 임신의 대부분; 3) 분만, 염증성 상태 ^1-7. 면역 세포는 모체 - 태아의 계면에서 염증 반응을 조절하는데 중요한 역할을하는 곳들이 풍부 임신 ^6-9 걸쳐 파악 변화.

인간으로, 산모 - 태아 인터페이스는 모성 (탈락) 태아 (융모막 또는 영양막 세포) 조직 사이의 직접 접촉의 영역을 나타냅니다. 1) 탈락 선 자궁강이 태반에 포함하지 않는 것이 parietalis과 병렬 인 :이 인터페이스는 포함융모막의 laeve에; 2)이 침입 trophoblasts ⁽¹⁰⁾ (그림 1)에 의해 침략하는 태반의 기초 판에있는 탈락의 basalis. 접촉이 지역의 친밀감은 산모의 면역 체계 ^11-13에 태아 항원 노출에 대한 조건을 만듭니다. 당연히 백혈구 전형적인 기질 형 세포 및 세포 선의 ^8,14,16 이외에 탈락 세포 ^8,9,14,15 30-40 %까지 포함한다. 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 역할은 영양막 세포의 침윤 ^(17)의 제한, 나선형 동맥 ^{(18, 19)의} 리모델링, 어머니의 허용 오차 ^{12, 20의} 유지 보수 및 노동 ^21-26의 개시를 포함하는 여러 프로세스를 포함한다. 적응 및 즉, T 세포, 대 식세포, 호중구, B 세포, 수지상 세포 및 NK 세포, 탈락 막 조직에서 확인되었다 면역계의 타고난 사지, 그 양의 백혈구비율 및 활성화 상태는 임신 ^{6-10,12,14,24,27-30} 걸쳐 공간적 및 시간적으로 변화시키는 것으로 나타났다. 백혈구 인구 및 / 또는 기능의 교란은 자연 유산 ^(31), 자간전증 ^(32), 자궁 내 성장 제한 ^{32, 33,} 및 조산 ^7,24과 연결되어 있습니다. 따라서, 인간의 모체 - 태아의 계면에서의 표현형 특성과 백혈구의 기능에 대한 연구는 임신 장애의 조절 곤란 면역 학적 경로의 해명을 촉진 할 것이다.

여러 매개 변수를 동시에 ^{34 ~ 36의} 정량 분석을 할 수 있습니다 유동 세포 계측법 된 표현형과 백혈구의 기능적 특성을 결정하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나, 기술. 유동 세포 계측법에 의한 백혈구를 분석하기 위해, 단일 세포 현탁액 내의 백혈구의 분리가 필요하다. 따라서, 방법은 레 침투 분리하는산모 - 태아 인터페이스에서 kocytes들은 표현형 및 기능적 특성을 연구하기 위해 필요합니다.

몇 가지 방법이 인간 모체 - 태아 인터페이스 ^{10,14,25,27,37-39로부터} 백혈구를 분리하는 기술되었다. 일부는 기계 세분화 ^{10,25,27,38을} 적용하는 동안, 다른 사람은 조직 분리에 대한 효소 소화 ^37,40를 사용합니다. 기계적인 세분화가 낮은 수율 및 감소 된 생존 ^41과 생존 세포 표면 마커 보유 ^{42에 영향을} 미칠 수있는 효소 적 분해를 생성하기 때문에, 본원에 기재된 방법은 세포 생존을 손상시키지 않고 절연 백혈구의 수율을 증가시키는 효소 전처리와 부드러운 기계적 해리를 결합한다. 방법의 유사한 조합이 모체 - 태아의 인터페이스 ^(39)에서 탈락 조직으로부터 백혈구 분리에 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, 본 명세서에 설명 된 프로토콜을 포함 메카반대 메스, 면도날, 또는 수술 가위 ^10,28 전통 닦지에 비해 시간과 노동을 절약하면서 일관성을 증가시키는 자동 조직 dissociator와 nical 세분화. 티슈 해리를 위해 선택된 효소 Accutase이었다. 일반적으로 사용되는 ⁴³ 콜라게나 제와는 달리, ⁴⁴ 디스 파제, 트립신 ⁴⁵ Accutase (세포 분리 용액)을 일반적으로 단백질 가수 분해하고 효율적인 아직 부드러운 ^{(46, 47)의} 해리에 기여 collagenolytic 활동 모두를 결합한다. 분리 후, 백혈구는 밀도 구배 원심 분리에 의해 탈락 막 세포의 전체 인구에서 농축된다. 각종 밀도 구배 매체는 이전 퍼콜 (콜로 이달 실리카 입자의 현탁액) ⁽⁴⁸⁾ 및 피콜 (합성 고 분자량의 중합체 자당) ^(49)이다 가장 일반적인 그중, 이용되어왔다. 크로스 폴리머에 의한 분리의 우수한 효율 previo있다usly ^50를 도시하고, 본 명세서에서 더 설명 프로토콜이 밀도 구배 매체 단핵구의 충분히 높은 순도를 생산하고 있음을 증명한다.

따라서, 본원에 기재된 프로토콜은 인간 탈락 조직으로부터 백혈구를 분리하는 밀도 구배 매체 (1.077 + 0.001 g / mL)로 자동 티슈 dissociator, 세포 분리 용액과 소화 효소, 백혈구 분리하여 기계적 조직의 세분화를 결합한다. 이 프로토콜은 세포 생존과 함께 세포 표면 항원을 유지하는 입증되었다. 고립 된 백혈구는 유동 세포 계측법 및 체외에서 기능 연구와 면역 표현형을 포함 여러 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 유동 세포 계측법에 의해 모두 면역을위한 준비에 탈락의 basalis과 탈락의 parietalis에서 백혈구 분리에 적합합니다. 또한, 분리 된 세포는 세포 분류, 세포 배양, RNA 분리 및 세포학에 사용될 수있다. 이 프로토콜에 언급 된 샘플 작업을 시작하기 전에, 인간의 윤리적 승인은 지역 연구 윤리위원회 및 기​​관 검토 보드에서 얻을 수 있어야합니다. 수집 및 연구 목적으로 인간의 샘플의 활용은 아동 보건 인간 개발 (NICHD)의 유니스 케네디 슈라이버 국립 연구소의 임상 시험 심사 보드, 건강 (NIH)의 국립 연구소, 보건 복지부 (DHHS에 의해 승인되었다 베데스다, 메릴랜드, 미국)와 웨인 주립 대학 (디트로이트, 미시간, 미국). 서면 동의서 전에 조직 샘플의 컬렉션에 모든 임산부로부터 얻은 것입니다.
참고 : 동물의 혈액, 세포, 또는 위험 작업하는 동안이 프로토콜에서 언급 한 바와 같이 OU에 에이전트, 그것은 적절한 바이오 안전성 및 실험실 안전 조치가 따라야하는 것이 필수적이다.

인간의 탈락 조직 1. 해부

주 : 기부 플레이트 아래 및 기부 태반에 부착되고 모체의 표면을 나타낸다. chorioamniotic 막은 양막과 융모막을 포함한다. 기초 판은 탈락의 basalis을 포함하고 융모막은 탈락의 parietalis (그림 1)을 포함한다.

1. 탈락 Basalis
   1. 태반 (도 1a 및 1b) 중 하나 자엽으로부터 기부 판의 부분을 해부.
   2. 위로 향 태반 융모와 멸균 커팅 보드에 배치합니다. 태반의 융모를 보여주는 측면은 일반적으로 모양 털이 조직과 피 묻은 빨간색입니다. 기초 판은 부드럽고 붉은 색 옅은입니다.
   3. VILL을 제거하기 위해 날카로운, 미세 포인트 가위와 집게를 사용하여OU를 조직과 혈관. 프로세스 (그림 1C) 동안 (무료 - - ²⁺ 및 마그네슘 ^칼슘) 1X PBS에 담가 조직을 유지합니다. 이 조각의 3에 2를 수집하고 혈액 (그림 1D)를 제거하는 1X PBS로 철저히 씻어.
2. 탈락 Parietalis
   1. chorioamniotic 세포막의 조각을 해부 (약 10cm는 10cm, 그림 1E을 X). 융모막이 위로 향하게하여 보드에 놓습니다. 융모막 쪽은 피의 응고를 포함하고 일반적으로 색에 노란 빛입니다.
   2. 가능 (그림 1E)로 혈전의만큼을 제거하는 미세 포인트 집게를 사용합니다. 1X PBS 분명히 실행될 때까지 막에서 여분의 혈액을 청소하는 멸균 1X PBS에서 막을 씻어.
   3. 부드럽게 막에서 탈락 층을 긁어 일회용 멸균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. MEM에 멸균 1X PBS 적용brane이 과정 (그림 1 층)을 완료한다. 탈락 조직을 수집하고 멸균 1X PBS (그림 1G)와 50 ㎖의 플라스틱 튜브에 배치합니다.

2. 기계 세분화 및 효소 소화

1. 50 ㎖의 플라스틱 튜브에 멸균 1X PBS로 (단계 1.1.3에서) 탈락의 basalis 해부 조직 또는 (단계 1.2.3에서) 탈락의 parietalis을 씻으십시오. 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 조직의 알약을 수집합니다.
2. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 조직 펠렛 위에있는 뜨는을 대기음.
   참고 : 그들은 적혈구 포함되어 있기 때문에이 시점에서, 펠릿은 매우 느슨. 펠릿의 부피에 대해 또는 3 ㎖ 미만이면, 세포 분리 용액 6 ml를 37 ℃로 미리 가온에 펠렛을 재 - 보류. 펠릿을 3 ml의 용적보다 더 크다면, 더 많은 세포 분리 용액을 추가 (토륨의 약 2 배를 추가조직 샘플의 전자 볼륨).
3. C 튜브에 균질 조직 (탈락의 basalis + 세포 분리 솔루션 또는 탈락 parietalis + 세포 분리 솔루션)를 전송합니다.
4. 자동 dissociator에서 C 튜브를 삽입하고 해당 프로그램을 실행합니다.
   참고 : 탈락의 basalis의 프로그램이 실행 당 668 총 라운드 17 초 동안 실행됩니다. 탈락의 parietalis의 프로그램이 실행 당 235 총 라운드 37 초 동안 실행됩니다. 이 프로그램은 탈락의 basalis 또는 좋은 수율 및 세포 생존과 탈락의 parietalis에서 백혈구를 분리 정의하고있다.
5. 이러한 accutase로서 시판 세포 분리 용액으로 조직 다이제스트, 조직의 세분화를 따라 기계적; 부드러운 교반과 함께 37 ℃에서 45 분 동안 (단백질 분해 및 collagenolytic 효소를 포함하는 칵테일).

백혈구 3. 분리

1. 인큐베이션 후, dige로 1X PBS 10 ㎖를 추가stion 혼합물과 50 ml의 플라스틱 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 소화 혼합물의 끈적 거림에 따라, 하나 하나의 혼합물에 대한 몇 가지 세포 여과기를 사용해야 할 수도 있습니다.
2. 실온에서 5 분 동안 300 XG에 1X PBS로 튜브와 원심 분리기를 입력합니다. 신중 세포 펠렛 위에 1X PBS를 제거하고 얼음처럼 차가운 FACS 완충액 5 mL를 펠릿을 다시 일시.
   참고 : 6.1 단계로 이동, 함께 다형과 단핵 백혈구을 연구; 단핵 백혈구을 연구하기 위해, 3.3 단계로 진행합니다.
3. 15 ml의 플라스틱 튜브에 20 %의 5 ml의 밀도 구배 매체 (1.077 + 0.001 g / ㎖)를 첨가하고, 서서히 밀도 구배 매체의 상부에 세포 현탁액을 오버레이. 샘플 적층 동안, 세포 현탁액 밀도 구배 매체를 혼합하지 않는 것이 중요하다.
4. 브레이크없이 4 ℃에서 30 분 동안 500 XG에 스윙 아웃 로터와 원심 분리기. 그것은 세포와 L을 혼합 방지하기 위해 브레이크를 해제하는 것이 매우 중요합니다그라디언트입니다 osing. 백혈구 밀도 구배 매체 및 FACS 버퍼 사이의 계면에서 발견 될 것이다.
5. 피펫을 사용하여 매우 신중 외과 버퍼와 세포 파편을 포함하는 상위 계층을 제거합니다. 계면에서의 밴드는 탈락 단핵 세포와 다형 핵 백혈구의 일부를 포함하고 있습니다.
6. 새로운 15 ml의 플라스틱 튜브로 완전히 계면에 세포를 옮긴다. 외과 버퍼의 최소 3 배 이상의 볼륨을 추가합니다.
7. 세포 펠릿을 5 분 동안 300 XG 원심 분리기. 뜨는을 기음과 외과 버퍼로 세포를 씻어. RT에서 5 분 동안 300 XG에 다른 원심 분리하여 세포를 펠릿 화.
   참고 : 6 단계를 참조하십시오, 모두 면역을 수행하려면 5 단계를 참조 셀 정렬을 수행하려면 4 단계를 참조 세포 배양을 수행 할 수 있습니다.

4. 응용 프로그램 - 세포 배양

1. USI 가능한 세포 개수를 RPMI 배지 1640 1 ㎖의 단계 3.7에서 세포를 다시 일시자동 세포 계수기 또는 혈구와 트리 판 블루 용액 0.4 %를 ng를.
2. 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 세포 농도를 만들기 위해 RPMI 배지의 양을 추가한다. 셀은 문화에 대한 준비가되어 있습니다.

5. 응용 프로그램 - 기본 세포 배양을위한 대 식세포의 분리

1. 자기 CD14 마이크로 비드 ⁽¹⁰⁷ 세포 당 20 ㎕의 비드)와 단계 3.7에서 세포를 라벨, CD14 + 세포를 분리하기 위해, 15 4 ℃에서 min으로하고, 자장을인가하여 다른 유형의 세포에서 분리 된 CD14 + 세포를 배양한다. MACS 완충액 및 자계의 제거와 2 세척 후에, MACS 완충액 자기 유지 CD14 + 세포를 용출.
2. 원심 분리 후, 다시 정지 세포 도금 (그림 2)에 대한 준비가 RPMI 배지 1640에서 세포 펠렛을.

6. 응용 프로그램 - 모두 면역

1. immunophenot의 세포를 사용하려면yping, 1X PBS 1 ㎖의 단계 3.7에서 세포를 다시 일시. 자동 세포 계수기 또는 혈구와 트리 판 블루 용액 0.4 %를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
2. 고칠 생존 염료 (그림 3)과 세포를 레이블. 외과 버퍼로 두 번 세포를 씻고 얼룩 버퍼에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 4 ° C에서 15 분 동안의 FcR 차단에 품어.
3. 형광 색소에 접합 세포 항체를 추가합니다. 예를 들어,이 프로토콜에서, 항 CD3을 사용, 항 CD19, 항 CD14, 항 CD15 그리고 항 CD56 항체 (표 1). 어둠 속에서 4 ℃에서 30 분 동안 품어.
4. 1X PBS 2 세척 후, 세포를 유동 세포 계측기를 사용하여 염색 완충액 500 μL를 분석한다. 탈락 조직에서 발견 백혈구 하위 집단을 분석하는 데 사용 게이팅 전략의 표현은도 4에 도시되어있다.

결과

. 산모 - 태아 인터페이스에서 인체 조직 (탈락의 basalis과 탈락의 parietalis)의 해부는 그림 1에 나타낸다이 절차는 탈락의 basalis (- D 그림 1A)를 포함하는 기초 판의 절개를 포함한다. 탈락 된 basalis는 기부 플레이트 (도 1C)에서 태반 융모 (태아 측)을 제거함으로써 얻어진다. 탈락의 parietalis 부드럽게 융모 막 (그림 1E - F)를 긁어에 의해 ?...

토론

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구 침투의 기능 및 표현형 특성의 특성은 임신 장애로 이어질 면역 메커니즘의 이해에 필수적이다. 몇 가지 기술은 임신 ^{10,14,25,28,37,42,43에} 걸쳐 인간의 모체 - 태아 인터페이스로부터 백혈구를 분리하기 위해 설명되었다. 그러나, 이들 기술들의 각각은 별개 항상 분리 된 세포의 생존 능력을 지정하지 않고, 가장 중요한 것은, 효소 또는 효소 결합 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubes	Any vendor
50 ml conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 ml round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30 μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15 ml safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator