בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Summary

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

הריון מאופיין בחדירה של כדוריות דם לבנות ברקמות הרבייה ובממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua). ממשק זה הוא האתר האנטומי של קשר בין האם ורקמות עוברים; לכן, זה אתר חיסוני של פעולה במהלך הריון. לויקוציטים מסתנן בממשק אימהי-העוברי לשחק תפקיד מרכזי בהשתלה, תחזוקת הריון, ועיתוי של מסירה. לכן, אפיונים פנוטיפי ופונקציונליים של לויקוציטים אלה יספק תובנה המנגנונים המביאים להפרעות הריון. כמה פרוטוקולים תוארו כדי לבודד חדירה לויקוציטים מbasalis decidua וparietalis decidua; עם זאת, חוסר העקביות בחומרים הכימיים, אנזימים, ופעמים של דגירה עושה את זה קשה להשוות תוצאות אלו. מתואר כאן היא גישה חדשנית המשלבת את השימוש בDiss המכני והאנזימטית העדיןטכניקות ociation לשמר את הכדאיות ויושרה של סמנים תאיים ו תאיים בלויקוציטים מבודד מהרקמות האנושיות בממשק אימהי-העוברי. מלבד immunophenotyping, תרבית תאים, ומיון תא, היישומים העתידיים של פרוטוקול זה הם רבים ומגוונים. בעקבות פרוטוקול זה, יכולים לשמש לויקוציטים המבודדים כדי לקבוע מתילציה DNA, ביטוי של גני המטרה, במבחנה פונקציונלי יקוציט (כלומר, phagocytosis, רעיל, התפשטות תאי T, וגמישות, וכו '), והייצור של מיני חמצן מגיבים בממשק אימהי-העוברי. בנוסף, באמצעות הפרוטוקול המתואר, מעבדה זו הייתה מסוגלת לתאר לויקוציטים החדשים והנדירים בממשק אימהי-העוברי.

Introduction

הריון מאופיין בשלושה שלבים ברורים חיסוניים: 1) השתלה וplacentation המוקדם הקשורים בתגובה פרו-דלקתית (כלומר, השתלה דומה "פצע פתוח"); 2) השליש השני ורוב השליש השלישי של הריון כאשר הומאוסטזיס חיסון מושגת באמצעות מדינה בעיקר אנטי דלקתית בממשק אימהי-העוברי; והמלטה 3), מדינה פרו-דלקתית ^1-7. תאים חיסוניים יש תפקיד חשוב בויסות התגובה הדלקתית בממשק אימהי-העוברי שבו השפע שלהם ושינוי הלוקליזציה במהלך הריון ^6-9.

בבני אדם, הממשק אימהי-עוברי מייצג אזור של קשר ישיר בין האימהי (decidua) ועובר (סיסית או trophoblast) רקמות. ממשק זה כולל: 1) decidua parietalis שקווי חלל הרחם אינו מכוסה על ידי השליה והוא בסמיכותלlaeve סיסית; ו -2) basalis decidua, ממוקם בצלחת הבסיס של השליה שבו הוא פלש trophoblasts ביניים ¹⁰ (איור 1). האינטימיות של תחומי מגע אלה יוצר תנאים לחשיפה עוברית לאנטיגני ^11-13 המערכת החיסונית של האם. שלא במפתיע, לויקוציטים מהווים עד 30-40% מתאי decidual ^8,9,14,15 בנוסף לתאי סטרומה-סוג טיפוסיים ותאי בלוטות ^8,14,16. התפקיד של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי כולל מספר רב של תהליכים הכוללים הגבלה של פלישת trophoblast ^17, שיפוץ של עורקים סליליים ^18,19, תחזוקה של סובלנות מצד ^12,20, וחניכה של עבודת ^21-26. לויקוציטים של שתי ההסתגלות וגפיים מולדים של מערכת החיסון, כלומר, תאי T, מקרופאגים, נויטרופילים, תאי B, תאים דנדריטים, ותאי NK, זוהו ברקמות decidual, ופרופורציות ומצב הפעלה הוכחו להשתנות מרחב ובזמן בכל הריון ^{6-10,12,14,24,27-30.} הפרעות באוכלוסיית יקוציט ו / או הפונקציה משויכות הפלה ספונטנית ^31, רעלת הריון ^32, הגבלת גדילה תוך-רחמית ^32,33, וצירים מוקדמים ^7,24. לכן, המחקר של המאפיינים פנוטיפי והפונקציונליות של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי יאפשר הבהרת המסלולים החיסוניים dysregulated בהפרעות הריון.

טכנולוגיה אחד הכלים החזקים ביותר המשמשים לקביעת הפנוטיפ ומאפיינים פונקציונליים של לויקוציטים הוא cytometry זרימה, המאפשרת ניתוח כמותי של פרמטרים מרובים בו זמנית ^34-36. כדי לנתח לויקוציטים ידי cytometry זרימה, נדרש בידוד של כדוריות דם לבנות בהשעית תא בודד. לכן, שיטה להפריד הסתננות Leuיש צורך kocytes מהממשק האימהי-העוברי ללמוד פנוטיפי ומאפיינים פונקציונליים.

כמה שיטות שתוארו לבודד את כדוריות דם לבנות מהממשק אימהי-העוברי האנושי ^{10,14,25,27,37-39.} בעוד כמה להחיל disaggregation המכני ^10,25,27,38, אחרים משתמשים עיכול אנזימטי ^37,40 לניתוק רקמה. בגלל disaggregation המכני מייצר תשואה נמוכה וכדאיות מופחתת ^41, וניתוק האנזימטית יכול להשפיע על כדאיות ופני תא שמירת סמן ^42, בשיטה המתוארת במסמך זה משלב ניתוק מכאני עדין עם האנזימטית מראש טיפול להגדיל את התשואה של לויקוציטים המבודד מבלי להתפשר על כדאיות תא. שילוב דומה של שיטות הודגם כיעיל בבידוד של כדוריות דם לבנות מרקמות decidual בממשק האימהי-העוברי ^39. לכן, הפרוטוקול המתואר במסמך זה כרוך Mechadisaggregation nical עם Dissociator רקמה אוטומטי שמגדיל עקביות תוך חיסכון בזמן ועבודה בהשוואה לגנדרני מסורתי עם אזמלים מנוגדים, סכיני גילוח, או מספריים כירורגיות ^10,28. האנזים שנבחר לניתוק רקמה היה Accutase. שלא כמו collagenase הנפוץ ^43, dispase ^44, וטריפסין ^45, Accutase (פתרון ניתוק תא) משלב את שני מפרקי חלבונים כלליים ופעילויות collagenolytic שתורמות לניתוק עדיין עדין יעיל ^46,47. לאחר ניתוק, לויקוציטים מועשר מהאוכלוסייה הכוללת של תאי decidual ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. תקשורת שיפוע צפיפות שונות כבר נוצלה בעבר, הנפוץ ביותר מהם Percoll (השעיה של חלקיקי סיליקה colloidal) ⁴⁸ וFicoll (פולימר של סוכרוז עם משקל מולקולרי סינטטי גבוה) ^49. היעילות מעולה של בידוד על ידי פולימר סוכרוז כבר previoמוצג usly ^50, והפרוטוקול המתואר במסמך נוסף מוכיח שתקשורת שיפוע צפיפות זו מייצרת טוהר גבוה מספיק של לויקוציטים mononuclear.

לפיכך, הפרוטוקול המתואר במסמך זה משלב disaggregation הרקמה המכני עם Dissociator אוטומטי רקמות, עיכול אנזימטי עם פתרון ניתוק תא, והפרדה לויקוציטים עם תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) כדי לבודד לויקוציטים מרקמות decidual אנושיות. פרוטוקול זה הוכח לשמר אנטיגנים פני תא יחד עם כדאיות תא. לויקוציטים המבודד יכול לשמש ליישומים מרובים הכוללים immunophenotyping עם cytometry זרימה ומחקרים תפקודיים במבחנה.

Protocol

פרוטוקול זה מתאים לבידוד יקוציט מbasalis decidua וparietalis decidua בהכנה לimmunophenotyping ידי cytometry זרימה. יתר על כן, התאים המבודדים יכולים לשמש למיון תא, תרבית תאים, בידוד RNA, וציטולוגיה. לפני העבודה עם הדגימות שהוזכרו בפרוטוקול זה, יש לקבל את האישור אתי אנושי מהוועדה המקומית לחקר האתיקה ולוחות סקירה מוסדית. האיסוף והניצול של דגימות אנושיות למטרות מחקר אושרו על ידי לוחות הסקירה המוסדית של המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר לבריאות ילד והתפתחות אדם (NICHD), מכון הלאומי לבריאות (NIH), מחלקת בריאות ושירותי אנוש (DHHS , Bethesda, MD, ארה"ב) והאוניברסיטה ויין סטייט (דטרויט, מישיגן, ארה"ב). נכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל הנשים בהריון לפני האוסף של דגימות רקמה.
הערה: בעת שעבדה בדם של בעלי חיים, תאים, או מפגעסוכני היחידות הארגוניות כאמור בפרוטוקול זה, זה חיוני כי בטיחות ביולוגית נכונה ופעולות בטיחות במעבדה להיות אחריו.

1. Dissection של רקמות Decidual האדם

הערה: צלחת הבסיס היא הבסיס מתחת ומחובר לשליה ומייצגת את פני השטח האימהיים. קרומי chorioamniotic כוללים amnion וסיסי. הצלחת הבסיסית כוללת basalis decidua והסיסי כולל parietalis decidua (איור 1).

1. Decidua basalis
   1. לנתח פיסת הצלחת הבסיסית מטבורית אחד של השליה (איורים 1 א ו -1 B).
   2. מניחים אותו על קרש חיתוך סטרילי עם villi השליה פונה כלפי מעלה. הצד מראה villi השליה הוא בדרך כלל אדום מדם עם רקמת שעיר במראה. צלחת הבסיס חלקה וחיוורת בצבע אדום.
   3. שימוש במלקחיים חדים, מספריים ועדין נקודה כדי להסיר את Villכלי רקמה ודם היחידות הארגוניות. לשמור על הרקמה הספוגה ב1x PBS (Ca ^{2 +} - וMg ^{2 +} - ללא תשלום) בתהליך (איור 1 ג). לאסוף 2-3 חתיכות אלה ולשטוף אותם ביסודיות עם 1x PBS להסיר הדם (1D איור).
2. Decidua Parietalis
   1. לנתח פיסת קרום chorioamniotic (כ 10 סנטימטרים x 10 סנטימטר, איור 1E). מניחים אותו על הלוח עם סיסית פונה כלפי מעלה. צד השליה מכיל קרישי דם, והוא בדרך כלל אור בצבע צהבהב.
   2. שימוש במלקחיים עדין נקודה כדי להסיר כמה שיותר קרישי הדם ככל האפשר (איור 1E). יש לשטוף את הקרום בסטרילי 1X PBS כדי לנקות את הדם העודף מהקרום עד PBS 1x פועל ברור.
   3. השתמש מגרד תא סטרילי חד פעמי כדי לגרד את שכבת decidual מן הקרום בעדינות. החל סטרילי 1X PBS על ממBrane בעת השלמת תהליך זה (איור 1F). אסוף את רקמות decidual ולמקם אותם בצינור פלסטיק 50 מיליליטר עם סטרילי 1X PBS (איור 1G).

2. מכאני disaggregation ואנזימתי עיכול

1. שטוף את הרקמה גזור מbasalis decidua (משלב 1.1.3) או parietalis decidua (משלב 1.2.3) עם סטרילי 1X PBS בצינור פלסטיק 50 מיליליטר. לאסוף כדורי רקמה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT.
2. לשאוב supernatant ממוקם מעל גלולה הרקמה בזהירות מבלי להפריע גלולה.
   הערה: בשלב זה, את כדורים הם רופפים מאוד משום שהם מכילים תאי דם אדומים. אם הנפח של גלולה הוא על או פחות מ 3 מיליליטר, מחדש להשעות את גלולה ב 6 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. אם גלולה היא גדולה יותר מאשר 3 מיליליטר של נפח, להוסיף עוד פתרון ניתוק תא (להוסיף על פי 2 הדואר נפח של דגימות הרקמה).
3. העבר את הרקמות הומוגני (basalis decidua + parietalis פתרון או decidua ניתוק תא + פתרון ניתוק תא) לצינור C.
4. מניחים את צינור C בDissociator האוטומטי ולהפעיל את התכנית המתאימה.
   הערה: התכנית לbasalis decidua פועלת לשניות 17 עם 668 סיבובים הכולל לטווח. התכנית לparietalis decidua פועלת לשניות 37 עם 235 סיבובים הכולל לטווח. תוכניות אלה מותאמים אישית כדי לבודד לויקוציטים מbasalis decidua או parietalis decidua עם תשואה טובה וכדאיויות תא.
5. בעקבות disaggregation המכני של הרקמות, לעכל את הרקמות עם פתרון ניתוק תא זמין מסחרי כגון Accutase; (קוקטייל המכיל מפרקי חלבונים ואנזימי collagenolytic) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.

3. בידוד של לויקוציטים

1. לאחר דגירה, להוסיף 10 מיליליטר של 1x PBS לDIGEתערובת stion ולהעביר אותו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור פלסטיק 50 מיליליטר. בהתאם לדביקות של תערובת העיכול, אחד ייתכן שיצטרך להשתמש בכמה מסננות תא לתערובת אחת.
2. מלא את הצינור עם 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על RT. הסר את PBS 1x מעל כדורי התא בזהירות מחדש להשעות את כדורים עם 5 מיליליטר של חיץ FACS קר כקרח.
   הערה: כדי ללמוד את כדוריות דם לבנות polymorphonuclear וmononuclear יחד, עבור לשלב 6.1; ללמוד לויקוציטים mononuclear, המשך לשלב 3.3.
3. הוסף 5 מיליליטר של 20% תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) לצינור פלסטיק 15 מיליליטר וכיסוי לאט ההשעיה התא על גבי מדיה שיפוע צפיפות. בעוד שכבות המדגם, חשוב לא לערבב תקשורת שיפוע צפיפות עם ההשעיה התא.
4. צנטריפוגה עם הרוטור את נדנדה-XG ב 500 במשך 30 דקות ב 4 C ללא הבלם. זה מאוד חשוב כדי לכבות את הבלם כדי למנוע ערבוב התאים וlosing השיפוע. לויקוציטים יימצא בממשק בין תקשורת שיפוע צפיפות וחיץ FACS.
5. הסר את השכבה העליונה המכילה את המאגר ופסולת תא FACS בזהירות בעזרת פיפטה. הלהקה בממשק מכילה תאי mononuclear decidual וחלק מכדוריות הדם לבנות polymorphonuclear.
6. להעביר את התאים בממשק לחלוטין לצינור פלסטיק 15 מיליליטר חדש. הוסף עוד נפח לפחות 3 פעמים של חיץ FACS.
7. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות לpelletize התאים. לשאוב supernatant ולשטוף את התאים עם חיץ FACS. Pelletize את התאים עם צנטריפוגה אחרת ב XG 300 במשך 5 דקות על RT.
   הערה: כדי לבצע את תרבית התאים, ראה שלב 4. כדי לבצע מיון תא, ראה שלב 5. כדי לבצע immunophenotyping, ראה שלב 6.

4. יישומים - תרבות סלולארי

1. להשעות מחדש התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות RPMI 1640. ספירת תאי קיימא using דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%.
2. להוסיף את הסכום של מדיום תרבות RPMI לעשות ריכוז תא של 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר. תאים מוכנים לתרבות החברה.

5. יישומים - בידוד של המקרופאגים לתרבית תאים ראשוניים

1. כדי לבודד CD14 + תאים, מגנטי התווית התאים משלב 3.7 עם microbeads CD14 (20 חרוזים μl לכל 10 ⁷ תאים), דגירה במשך 15 דקות ב 4 C, וCD14 נפרד + תאים מסוגים אחרים של תאים על ידי הפעלת שדה מגנטי. לאחר 2 שטיפות עם חיץ MACS וההסרה של השדה המגנטי, elute תאי CD14 + עודפים המגנטיים עם חיץ MACS.
2. בעקבות צנטריפוגה, מחדש להשעות את כדורי התא בינוני תרבות RPMI 1640. התאים מוכנים לציפוי (איור 2).

6. יישומים - immunophenotyping

1. כדי להשתמש בתאים לimmunophenotyping, מחדש להשעות את התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של 1x PBS. ספירת תאי קיימא באמצעות דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%.
2. תווית התאים עם צבע ניתן לתקן כדאיות (איור 3). לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ FACS מחדש להשעות את התאים במאגר כתם. דגירה עם חוסם FCR במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
3. להוסיף נוגדנים תאיים מצומדת לfluorochromes. לדוגמא, בפרוטוקול זה, להשתמש באנטי-CD3, נוגדנים נגד CD19, אנטי CD14, אנטי CD15, ואנטי-CD56 (טבלה 1). דגירה של 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
4. לאחר 2 שטיפות עם 1x PBS, התאים ינותחו ב500 μl של חיץ כתם באמצעות cytometer זרימה. ייצוג של אסטרטגית gating להשתמש כדי לנתח את תת-האוכלוסיות לויקוציטים נמצאו ברקמות decidual מוצג באיור 4.

תוצאות

. הנתיחה של רקמות אנושיות בממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua) מוצגת באיור 1 הליך זה כולל את הנתיחה של הצלחת הבסיסית, הכוללת את basalis decidua (איור 1 א - ד). Basalis decidua מתקבל על ידי הסרת villi השליה (הצד עוברי) מצלחת הבסיס (איור 1 ג). Parietalis decidua ?...

Discussion

אפיון התכונות הפונקציונליות ופנוטיפי של חדירה לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי הוא חיוני להבנה של מנגנוני החיסון שיובילו להפרעות הריון. כמה טכניקות שתוארו כדי לבודד לויקוציטים מהממשק אימהי-העוברי האנושי במהלך הריון ^{10,14,25,28,37,42,43.} עם זאת, כל אחד מטכניקות אל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubes	Any vendor
50 ml conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 ml round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30 μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15 ml safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator