JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Аннотация

Беременность характеризуется инфильтрацией лейкоцитов в репродуктивных тканях и на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis). Этот интерфейс анатомическая контакта между материнской и эмбриональных тканей; Таким образом, это иммунологическое местом действия во время беременности. Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода играют центральную роль в имплантации, обслуживание беременности, и сроки доставки. Таким образом, фенотипические и функциональные характеризации этих лейкоцитов обеспечит понимание механизмов, приводящих к нарушению беременности. Несколько протоколы были описаны для того, чтобы изолировать от проникновения лейкоцитов децидуальной базального и децидуальной parietalis; Однако, отсутствие согласованности в реагентов, энзимов, и времени инкубации затрудняет сравнение этих результатов. Описанный в настоящем документе, новый подход, который сочетает в себе использование нежных механических и ферментативных диссметоды ociation сохранить жизнеспособность и целостность внеклеточного и внутриклеточного маркеров в лейкоцитах, выделенных из тканей человека на границе материнской плода. Помимо иммунофенотипирования, культуры клеток, и сортировки клеток, будущие применения этого протокола многочисленны и разнообразны. После этого протокола, выделенные лейкоциты могут быть использованы для определения метилирование ДНК, экспрессию генов-мишеней, в пробирке функциональности лейкоцитов (т.е. фагоцитоза, цитотоксичность, пролиферацию Т-клеток, и пластичности и т.д.), а также производство активных форм кислорода на границе материнской плода. Кроме того, с помощью описанного протокола, эта лаборатория была в состоянии описать новые и редкие лейкоциты на границе материнской плода.

Введение

Беременность характеризуется тремя различными иммунологическими фаз: 1) имплантация и в начале плаценты связаны с про-воспалительной реакции (т.е., имплантация напоминает "открытая рана"); 2) во втором триместре, и большинство из третьего триместра беременности, когда иммунного гомеостаза достигается через преимущественно противовоспалительным государства на границе материнской плода; и 3) роды, про-воспалительных состояние 1-7. Иммунные клетки играют важную роль в регуляции воспалительной реакции на границе материнской плода, где их численность и изменение локализации во время беременности 6-9.

У человека, интерфейс материнской плода представляет собой область непосредственного контакта между материнской (децидуальной) и плода (хориона или трофобласта) тканей. Этот интерфейс включает в себя: 1) децидуальной parietalis, что линии полости матки не распространяется на плаценту и в сопоставлениив хориона laeve; и 2) децидуальной базального, расположенные в базальной пластинки плаценты где она вторглась интерстициальными трофобластов 10 (рисунок 1). Интимность этих областях контакта создает условия для антигенной плода воздействия материнской иммунной системы 11-13. Не удивительно, лейкоциты содержат до 30-40% клеток плаценты 8,9,14,15 в дополнение к типичным стромальных клеток типа и железистых клеток 8,14,16. Роль лейкоцитов на границе материнской плода включает несколько процессов, которые включают ограничение трофобласта вторжения 17, реконструкцию спиральных артерий 18,19, обслуживание материнской толерантности 12,20, и посвящение труда 21-26. Лейкоциты как адаптивных и врожденных конечностей иммунной системы, то есть, Т-клетки, макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты, дендритные клетки, и клетки NK, были определены в децидуальных тканей, и ихпропорции и статус активации, как было показано в пространственном и временном меняться в течение беременности 6-10,12,14,24,27-30. Возмущения в популяции лейкоцитов и / или функции, связанные с самопроизвольным абортом, 31 преэклампсии 32, внутриутробной задержки роста 32,33 и преждевременных родов 7,24. Таким образом, изучение фенотипических характеристик и функциональности лейкоцитов на границе материнской плода человека будет способствовать выяснению иммунологических путей Нарушение регуляции при нарушениях беременности.

Один из самых мощных инструментов, используемых для определения фенотипа и функциональных свойств лейкоцитов проточной цитометрии, технология, которая позволяет проводить количественный анализ нескольких параметров одновременно 34-36. Для анализа лейкоцитов методом проточной цитометрии, изоляция лейкоцитов в одной клеточной суспензии требуется. Таким образом, способ отделить проникновения Leukocytes из интерфейса материнской плода необходимо изучить их фенотипические и функциональные свойства.

Некоторые методы были описаны, чтобы изолировать лейкоциты от человеческого материнской плода интерфейс 10,14,25,27,37-39. В то время как некоторые применяются механические разукрупнение 10,25,27,38, другие используют ферментативного расщепления 37,40 для тканевой диссоциации. Из-за механической дезагрегации дает меньший выход и снижает жизнеспособность 41 и ферментативной диссоциации может повлиять на жизнеспособность клеточной поверхности и удержание маркера 42, описанный здесь способ сочетает нежную механическую диссоциацию с ферментативной предварительной обработки, чтобы увеличить выход изолированных лейкоцитах без ущерба жизнеспособности клеток. Аналогичное сочетание методов была продемонстрирована эффективность в изоляции лейкоцитов из децидуальной ткани на материнской плода интерфейс 39. Таким образом, протокол, описанный здесь, включает мехаское разбивка с автоматической диссоциации ткани, что увеличивает согласованность, экономя время и труд по сравнению с традиционными измельчения с противоположными скальпелей, бритвенные лезвия, или хирургическими ножницами 10,28. Фермент выбрали для ткани диссоциации был Accutase. В отличие от обычно используемого коллагеназы 43, диспазу 44, и трипсин 45, Accutase (раствор клеток отряд) сочетает в себе как общие протеолитической и коллагенолитических мероприятий, способствующих эффективному пока нежным диссоциации 46,47. После диссоциации, лейкоциты обогащены от общей численности населения децидуальных клеток центрифугированием в градиенте плотности. Различные градиент плотности носителя были ранее использованы, наиболее распространенным из которых являются перколлом (суспензии коллоидных частиц кремнезема) и 48 (Ficoll полимер сахарозы с высокой молекулярной массой синтетической) 49. Более высокая эффективность изоляции от сахарозы полимера была Previously показано 50, и протокол, описанный в данном документе дополнительно доказывает, что этот градиент плотности носителя производит достаточно высокую чистоту мононуклеарных лейкоцитов.

Следовательно, протокол описано здесь сочетает в себе механическую ткани дезагрегации с автоматической диссоциации ткани, ферментативным расщеплением с раствором открепления клеток, лейкоцитов и разделения с градиентом плотности сред (1,077 + 0,001 г / мл), чтобы изолировать лейкоцитов из плаценты человека ткани. Этот протокол был доказан, чтобы сохранить антигены на поверхности клеток, а также жизнеспособности клеток. Выделенные лейкоциты могут быть использованы для различных приложений, которые включают иммунофенотипирование с проточной цитометрии и функциональных исследований в пробирке.

протокол

Этот протокол подходит для изоляции лейкоцитов из децидуальной базального и децидуальной parietalis в подготовке к иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Кроме того, отдельные клетки могут быть использованы для сортировки клеток, культуры клеток, выделения РНК, и цитологии. Перед началом работы с образцами, указанных в этом протоколе, этические утверждения человеческого должно быть получено от Комитета по этике местного научно-исследовательского и организационного обзора советов. Сбор и утилизация образцов человека для исследовательских целей были одобрены этическими советами Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и развития человека (NICHD), Национальный институт здоровья (NIH), Департамент здравоохранения и социальных служб (DHHS , Bethesda, MD, USA) и Wayne State University (Детройт, Мичиган, США). Письменное информированное согласие было получено от всех беременных женщин до сбора образцов тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с крови животных, клетки, или опасностиленные агенты, как указано в этом протоколе, важно, что надлежащее биобезопасности и действий по обеспечению безопасности лабораторных следовать.

1. Вскрытие децидуальной тканей человека

Примечание: базальная пластинка является базовым ниже и прикреплен к плаценте и представляет собой материнскую поверхность. В chorioamniotic мембраны включают амнион и хорион. Базальная пластинка включает в себя децидуальной базального и хориона включает децидуальной parietalis (рисунок 1).

  1. Децидуальной базального
    1. Рассеките кусок донца от одного семядолей плаценты (фиг.1А и 1В).
    2. Поместите его на стерильную разделочной доске с плацентарных ворсинок вверх. Сбоку через плацентарный ворсинки, как правило, кровавый красный с волосатой ткани по внешнему виду. Базальная пластинка гладкая и светло-красного цвета.
    3. Используйте острые, прекрасно точкой ножницы и пинцет, чтобы удалить Villленные ткань и кровеносные сосуды. Держите ткани, смоченной в 1x PBS (Ca 2+ - и Mg 2+ - бесплатно) в процессе (рис 1в). Соберите 2 до 3 из этих частей и тщательно промойте их 1x PBS, чтобы удалить кровь (рис 1D).
  2. Децидуальной Parietalis
    1. Проанализируйте кусок chorioamniotic мембран (примерно 10 см х 10 см, рис 1E). Поместите его на доске с хориона вверх. Хорионический сторона содержит кровавые сгустки и обычно светло-желтоватого цвета.
    2. Используйте тонкой точкой щипцов, чтобы удалить как многие из сгустков крови, а возможно (рис 1E). Промойте мембрану в стерильной PBS 1x для очистки избыток крови из мембраны до 1x PBS, не станет чистой.
    3. Использование одноразовых стерильных скребок клеток осторожно очистить слой децидуальной из мембраны. Применить стерильную 1x PBS на MEMбран, а завершить этот процесс (рис 1F). Сбор децидуальной ткани и поместите их в 50 мл пластиковую трубку со стерильным 1x PBS (рис 1G).

2. Механическая Разбивка и ферментативного расщепления

  1. Промыть ткань расчлененный от децидуальной базального (со стадии 1.1.3) или децидуальной parietalis (со стадии 1.2.3) с стерильной PBS 1x в 50 мл пластиковую пробирку. Сбор тканей гранул путем центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
  2. Аспирируйте супернатант, расположенную над ткани гранул тщательно, не нарушая гранул.
    Примечание: В этот момент, гранулы очень свободно, поскольку они содержат эритроциты. Если объем гранул составляет около или менее 3 мл, повторно приостанавливать осадок в 6 мл раствора открепления клеток предварительно нагретой до 37 ° С. Если осадок больше, чем 3 мл объема, добавить больше клеток отряд решение (добавить го примерно в 2 разае объем образцов ткани).
  3. Передача гомогенизированных тканей (децидуальной базального + клеток отряд решение или децидуальной parietalis + раствор клеток отряд) в C трубки.
  4. Поместите трубку C в автоматическом диссоциации и запустить соответствующую программу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программа для децидуальной базального работает на 17 сек с 668 общих выстрелов в перспективе. Программа для децидуальной parietalis работает 37 сек с 235 общих выстрелов в перспективе. Эти программы были настроены, чтобы изолировать лейкоциты от децидуальной базального или децидуальной parietalis с хорошим выходом и жизнеспособности клеток.
  5. После механической дезагрегации тканей, переварить ткани с коммерчески доступных клеток отряд решения, таких как Accutase; (Коктейль, содержащий протеолитической и коллагенолитические ферменты) в течение 45 мин при 37 ° С при легком помешивании.

3. Выделение лейкоцитов

  1. После инкубации, добавить 10 мл 1x PBS в DigeStion смесь и передать его через сито 100 мкм клеток в 50 мл пластиковую трубку. В зависимости от липкости обрабатываемой смеси, можно нужно использовать несколько клеток фильтры для одной смеси.
  2. Заполните трубку с 1x PBS и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Извлеките 1X PBS выше осадков клеток тщательно и повторно приостанавливать гранул с 5 мл охлажденного льдом буфера FACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения полиморфноядерных лейкоцитов и мононуклеарных вместе, перейдите к шагу 6.1; изучить одноядерные лейкоциты, перейдите к шагу 3.3.
  3. Добавляют 5 мл 20% градиенте плотности носителей (1,077 + 0,001 г / мл) до 15 мл пластиковую пробирку и медленно наложения клеточной суспензии в верхней части градиента плотности сред. В то время как наслоение образца, важно, чтобы не перепутать градиент плотности среды с клеточной суспензии.
  4. Центрифуга с поворотно-откидной ротор на 500 мкг в течение 30 мин при 4 ° С без тормоза. Это очень важно, чтобы выключить тормоз, чтобы избежать смешивания клеток и лosing градиент. Лейкоциты можно найти в интерфейсе между градиентом плотности сред и буфера FACS.
  5. Снимите верхний слой, содержащий буфера и клеток мусора FACS очень тщательно с помощью пипетки. Полоса интерфейса содержит децидуальной мононуклеарных клеток и часть из полиморфно-ядерных лейкоцитов.
  6. Передача клеток на поверхности раздела полностью новой 15 мл пластиковую пробирку. Добавить по крайней мере, в 3 раза больше объема FACS буфера.
  7. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки. Аспирируйте супернатант и промыть клетки с буфером FACS. Гранулировать клетки с другим центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения клеточной культуры см Шаг 4. Для выполнения сортировки клеток, см Шаг 5. Для выполнения иммунофенотипирование см Шаг 6.

4. Приложения - Клеточные культуры

  1. Повторное приостановить клетки с шага 3.7 в 1 мл RPMI питательной среды 1640. Количество жизнеспособных клеток USIнг автоматического счетчика клеток или гемоцитометра и -ным раствором трипанового синего 0,4%.
  2. Добавить до количества культуральной среды RPMI, чтобы концентрацию клеток 1 × 10 6 клеток / мл. Клетки готовы к культуре.

5. Приложения - Выделение макрофагов для первичной культуре клеток

  1. Чтобы изолировать CD14 + клеток, магнитно маркировать клетки, полученный на стадии 3.7 с CD14 микросфер (20 мкл шариков на 10 7 клеток), инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С, и отдельный CD14 + клеток от других типов клеток путем приложения магнитного поля. Через 2 промывками буфером MACS и удаления магнитного поля, вымывания магнитно сохраненные CD14 + клеток с MACS буфера.
  2. После центрифугирования, повторно приостанавливать клеток гранул в культуральной среде RPMI 1640. клетки готовы для покрытия (рисунок 2).

6. Приложения - иммунофенотипирование

  1. Чтобы использовать клетки для immunophenotyping, повторно приостанавливать клетки с шага 3.7 в 1 мл 1x PBS. Количество жизнеспособных клеток с использованием автоматического счетчика клеток или гемоцитометра и -ным раствором трипанового синего 0,4%.
  2. Этикетка клетки с фиксируемой жизнеспособность красителя (рис 3). Промыть клетки дважды FACS буфере и вновь приостановить клеток в буфере пятен. Инкубируйте с блокатором FcR в течение 15 мин при 4 ° С.
  3. Добавить внеклеточные антитела, конъюгированные с флуорохромами. Например, в данном протоколе, использовать анти-CD3, анти-CD19, анти-CD14, анти-CD15 и анти-CD56 антитела (таблица 1). Инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
  4. Через 2 промывками 1x PBS, клетки будут проанализированы в 500 мкл буфера окрашивания с использованием проточного цитометра. Представление стратегии стробирования, используемой для анализа лейкоцитов субпопуляции, найденные в тканях плаценты показано на рисунке 4.

Результаты

. Рассечение тканей человека на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis) показано на рисунке 1 Эта процедура включает в себя вскрытие донца, которое включает децидуальной базального (рис 1А - D). Децидуальной базального получае?...

Обсуждение

Характеристика функциональных и фенотипических свойств проникновения лейкоцитов в интерфейсе материнской плода человека имеет важное значение для понимания иммунных механизмов, приводящих к нарушению беременности. Некоторые методы были описаны для того, чтобы изолировать лейкоци?...

Раскрытие информации

The authors disclose no conflicts of interest.

Благодарности

Эта работа была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития, NIH / DHHS. Эта работа также была поддержана, в частности, в университет перинатального инициативы Wayne State в материнской, перинатальной и детского здоровья. Мы выражаем глубокую признательность Морин McGerty (Wayne State University) за критических показаний рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers Any vendor20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)Life Technologies(1X PBS)
Large and small Petri dishesAny vendor
Dissociation
AccutaseLife TechnologiesA11105-01(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubesAny vendor
50 ml conical centrifuge tubesAny vendor
100 µm cell strainersFALCON/Corning352360
5 ml round bottom polystyrene test tubesAny vendor
Transfer pipettesAny vendor
C tubesMiltenyi Biotec130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640 Life Technologies22400-089(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slidesThermo Scientific177437
IncubatorThermo Scientific CorporationHEPA Class 100
Water bathFisher ScientificISOTEMP 110
Cell counterNexelcomCellometer Auto2000
MicroscopeOlympusOlympus CKX41
Cell Separation
MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Cell separatorMiltenyi Biotec130-042-109
30 μm pre-separation filtersMiltenyi Biotec130-041-40
MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
15 ml safe-lock conical tubesAny Vendor
MACS buffer (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR BlockingMiltenyi Biotec130-059-901(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies BD Biosciences(Table 1)
Bovine serum albumin SigmaA7906
LIVE/DEAD viability dyeBD Biosciences564406
Lyse/Fix buffer BD Biosciences346202
FACS buffer (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer BD Biosciences554656
Trypan Blue solution 0.4%Life Technologies15250-011
FicollGE Healthcare17-1440-0220% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shakerThermo ScientificMAXQ 4450
Flow cytometerBD BiosciencesLSR-Fortessa
Centrifuge Beckman CoulterSpinChron DLX
Vacuum systemAny vendor
Automatic tissue dissociator Miltenyi BiotecgentleMACS Dissociator

Ссылки

  1. Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
  2. Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, S33-S46 (2003).
  3. Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
  4. Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M. Inflammatory pathways in the mechanism of parturition. BMC Pregnancy Childbirth. 7, S7 (2007).
  5. Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
  6. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  7. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
  8. Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
  9. Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E. Immune cells in the placental bed. Int J Dev Biol. 54 (2-3), 281-294 (2010).
  10. Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
  11. Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
  12. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  13. Christiansen, O. B. Reproductive immunology. Mol Immunol. 55 (1), 8-15 (2013).
  14. Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
  15. Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
  16. Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
  17. Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy--a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
  18. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  19. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, ., B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  20. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  21. Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
  22. Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
  23. Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
  24. Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
  25. Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
  26. Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
  27. Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
  28. Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
  29. Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
  30. Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
  31. Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
  32. Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
  33. Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
  34. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  35. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
  36. Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
  37. Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
  38. Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
  39. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), 41-11 (2012).
  40. Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
  41. Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
  42. White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
  43. Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
  44. Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
  45. Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
  46. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  47. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  48. Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
  49. Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
  50. Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
  51. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  52. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  53. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

99AccutaseParietalis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены