一个具体的感觉细胞的共聚焦相关和3D电子显微镜

摘要

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

摘要

一个细胞的超微结构的划分对于理解它的功能很重要。这可以是在整个制成多种类型的细胞，如肠上皮的内分泌细胞的组织扩散稀有细胞类型是一项艰巨的项目。食物和细菌的这些胃肠传感器已很难研究，因为它们以1:1的比例分散在其他的上皮细胞:1,000。最近，转基因报告小鼠已经产生荧光的手段，以确定肠内分泌细胞。其中之一是将肽YY-GFP小鼠。使用这款鼠标，我们开发了一种方法来关联焦和串行块面部扫描电子显微镜。我们命名方法cocem3D并应用它来识别特定的肠内分泌细胞在组织中推出3D细胞的超微结构。 cocem3D的分辨率是足够的，以确定细胞器一样小分泌囊泡和区分细胞膜为卷重ndering。 Cocem3D可以很容易地适应研究其它特定的细胞类型的三维超微结构其天然组织中。

引言

生活在细胞内发生的时间和空间。随着时间的推移改变使用时间推移显微镜结合荧光成像技术，如超高分辨率显微镜经常研究。空间，特别是细胞或细胞 - 细胞相互作用内细胞器的结构中，只能由一个完整的帐户细胞的微细结构的衍生。综合考虑一个细胞的微细结构也能带来清晰基因组功能的情况下的基因组是可用的，像C.线虫线虫¹或平面placozoa tricoplax粘着^2。连续切片电子显微镜现在是一个可再现的，时间效率，和更便宜的任务由于自动化3D电子显微镜技术的发展，例如串行块面扫描电子显微镜^{3（SBEM）。}

需要进行结构信息阐明的功能是在一定的CEL非常明显升类型，其中功能取决于物理的细胞 - 细胞相互作用，如神经元，神经胶质细胞，或感觉上皮细胞。我们是在阐明从在肠道的管腔养分感觉信号如何被转导到最终调制欲求行为的电信号特别感兴趣。该电路是复杂的，但开始在肠的壁，其中营养物质接触到感觉上皮细胞，称为肠内分泌细胞接触。不像其他感官上皮细胞，如味觉细胞，肠内分泌细胞在整个肠上皮的一个的比率分散到千^4-7。因此，他们已经很难确定和研究，并且很长一段时间，他们只能作为胃肠激素的来源。但与细胞特异性的荧光报告小鼠的发展，这些细胞的复杂感觉功能正在出现。使用一个这些记者老鼠，肽YY-GFP（PyyGFP）小鼠，我们发现，enteroendocrINE细胞有显着的胞质尾，我们命名为neuropod。 neuropods的外观建议在细胞 - 细胞通信的保守功能。因此，我们推断，通过记录一个肠内分泌细胞的超微结构，neuropods的功能可以被衍生。

理解在分散细胞，其是难以识别的附属物的结构的需要是开发一种方法，以共聚焦显微镜和SBEM结合的主要理由。鉴定使用PyyGFP肠内分泌细胞特异报告小鼠感兴趣的细胞。该方法使我们能够记录的肠内分泌细胞及其neuropod整个超微结构。在neuropods，我们发现神经元轴突的结构特点，并neuropods外，我们发现肠神经胶质⁸肉体关系。的确，neuropods含有约70％的分泌囊泡表明在这些细胞的分泌功能中起重要作用的。建筑上的结构数据，最近我们发现，通过这些neuropods，肠内分泌细胞和神经元支配肠道形成神经上皮电路，在舌头^8,9类似口味细胞。

使用此相关显微镜方法揭开的化学感受胃肠等机制的特点，从结构数据收集源于。我们认为这种方法可以是在细胞生物学的其他领域，特别是在细胞组织内以非常低的比率分散有用。我们提到的方法，相关的共聚焦和串行块面部扫描电子显微镜在三维（Cocem3D）。该方法包括以下主要步骤:组织解剖，共焦显微镜，SBEM成像，SBEM和共焦图象的相关性，并手工分割。相对于其他相关方法，这个概念是相当简单的，因为相关的物理而不是化学。

研究方案

所有的动物保健和实验，按照批准的杜克大学机构动物护理和使用委员会的协议进行。

Cocem3D从先前公布的协议^10,11的组合和朵朵在这里用于研究使用PyyGFP记者¹²鼠标特定的肠内分泌细胞。使用市售的转基因报告小鼠这种方法可以容易地应用于其他感兴趣的细胞。相关共焦显微镜，串行块面扫描电子显微镜（SBEM），和数据呈现在3D:该方法在三个部分中描述。

相关共聚焦显微镜

这一节的目的是收获自尺寸允许相关共焦和SBEM成像的远端结肠组织段。协议如下:

1.收获的组织

1. 准备将10ml PBS中50μg/ ml的肝素溶液。
2. 通过混合10毫升氯胺酮（100毫克/毫升）和1ml甲苯噻嗪（20毫克/毫升）制备甲苯噻嗪/氯胺酮麻醉的库存。
   1. 稀释甲苯噻嗪/氯胺酮股票1:4在0.1M PBS。
3. 制备100毫升含有4％多聚甲醛和0.1％戊二醛的PBS中固定剂溶液。
4. 麻醉一个PyyGFP鼠标，6〜10周龄，用致死剂量的甲苯噻嗪/氯胺酮麻醉。腹腔注射麻醉剂以每20克鼠标重量0.15毫升
5. 确认正确鼠标麻醉按捏的尾巴或脚趾，并使用软膏的眼睛，以防止干燥。
6. 使用一个可变流量的蠕动泵灌注固定液心内^10。用手术剪（13厘米长）剖开腹腔，露出肠子，心脏和肺。保持心脏窄图案弯钳（12厘米长），并插入来自蠕动泵蝴蝶针（19克）我NTO左心室。随即，切右心房与弹簧剪刀直（长度为4毫米）。灌注以2ml / min的速率首先用1分钟肝素溶液，然后用15分钟冰冷固定液直到小鼠的尾巴是完全刚性的。
   注意:灌注以缓慢的速度，以防止小血管破裂在肠粘膜是非常重要的。血管破裂会危及组织的超微结构。如果灌注量充足，肝脏应在3-5分钟变成苍白色。
7. 用小剪刀打开腹腔并切除从与盲肠到远端直肠交界整个结肠。放置在冰冷的PBS中的组织。虽然淹没在PBS，剖开小弹簧剪刀沿肠系膜结肠。

2.解剖和修复组织片段

1. 使用手术刀，从远端结肠削减约6小组织片段（2平方^毫米 ）。这样做在一张纸上Ø˚F牙模和淹没在几滴PBS的。
2. 在4℃下后固定在固定剂溶液中的组织片段3小时。

3.微解剖组织块

1. 制备5％低熔点琼脂糖在PBS中并保持在水浴中于45℃。
2. 嵌入的组织片段在5％低熔点琼脂糖使用小塑料容器，如标准尺寸的组织-Tek的Cryomold。
3. 安装嵌入部分在振动刀切片机，并填写缓冲液盘与冰冷的PBS。
4. 削减300微米组织带0.8的幅度和0.04毫米/秒的速度。注意:在这一点上，将组织条将从琼脂糖抛下。
5. 重新嵌入300微米组织带在琼脂糖并安装它们切片垂直于vibratome的刀片。
6. 使用振动，切割组织带，其厚度为50微米。注意:最终组织块应为约300微米宽×50微米厚。这些ðimensions从导频共焦实验结果，表明肠内分泌细胞的厚度为15-20微米，neuropod的长度30-70纳米之间优化。因此，一个完整的细胞可以包含组织300微米宽的一个块内通过50微米厚的，如果细胞的取向是平行于组织块的面。变化这些尺寸取决于所感兴趣的组织和细胞类型。
7. 存储在PBS中的组织块，在4℃。

4.共焦成像

1. 4000:通过在1在PBS稀释的DAPI准备一个核染色解决方案。
2. 孵育在DAPI核染色的组织块5分钟。注意:DAPI染色通过细胞核，这是用于关联的共焦和SBEM图像有益便于区分单个细胞。
3. 在充电载玻片山组织块，加入几滴的PBS，并用盖玻片覆盖它们。
4. 利用共聚焦显微镜，确定块s的完整绒毛和感兴趣PyyGFP细胞和成像他们获得的z堆栈光学切面。
   1. 使用20X / 0.8蔡司计划复消色差透镜的目标，以获得Z-栈1微米的光学切片。
   2. 用于Z-栈，使用的声道为405nm的吲哚（DAPI），以确定关系到其他细胞，488纳米内源性的GFP本地化感兴趣的细胞，和微分干涉对比（DIC），以确定到细胞相对的位置内腔。
   3. 使用1,024像素或更高的图像分辨率。

5.嵌入块琼脂糖

1. 制备10ml含有4％多聚甲醛和2.5％戊二醛的PBS中固定剂。
2. 通过小心地加入的PBS在盖玻片的边缘滑动盖玻片远离载玻片而不损伤组织块中删除从载玻片上的组织块。然后，使用一个精美的艺术画笔从幻灯片转移的组织块到10.5毫升含有4％多聚甲醛和2.5％戊二醛固定剂的离心管。
3. 定位后的组织块O / N在4℃。
4. 转移的组织块PBS。然后，嵌入块平板在5％由两片玻璃载片之间夹入它们的低熔点琼脂糖。
   注:嵌入在薄层琼脂糖块染色过程中简化后的操作。
5. 切琼脂糖在一个正方形，并​​作出缺口上风侧。注意:该步骤是必要的，以保持在后续步骤中的取向。
6. 商店块在1.5 ml离心管，用PBS于4℃直至进一步处理。

串行块面部扫描电子显微镜（SBEM）

在本节中，将组织块制备和成像的SBEM在低倍率。块表面的观察图像，然后用共焦数据相关，以确定含有目的细胞的区域。一旦该区域被识别，所述组织被成像在为7nm /像素和为70nm的切片的分辨率。这是足以解决和其他细胞器区分大致密核心分泌囊泡。在肠内分泌细胞中，这种类型的小泡的100至150纳米，直径¹³变化。协议如下:

6.染色组织切片

1. 从PBS中去除组织和冲洗在0.1M二甲胂酸盐缓冲液三次，每次5分钟，。
2. 溶解在0.1M二甲胂酸盐缓冲液染色块1小时在0.1％的单宁酸，以提高细胞膜¹⁴的对比度。
3. 根据公布的协议¹¹进行随后的染色和组织的脱水。以下Deerinck等。协议，准备这些解决方案:1）01％（重量/体积）thiocarbonhydrazide（THC）; 2）导致天冬氨酸溶液; 3）1％乙酸双氧铀，和4）锇tetraoxyde /亚铁氰化钾（OSO ₄ / K亚铁氰化物）。混合4％OSO ₄倍和2倍ķ亚铁股票以10.3克ķ亚铁和0.86克娜卡可酸盐在10毫升H ₂ O]:1的比例，使OSO ₄ / K亚铁。注:具有嵌入在琼脂糖组织染色过程中便于操作。小心取出琼脂糖后续树脂浸润。
4. 冲洗样品三次，每次5分钟，在0.1M二甲胂酸盐缓冲液，然后染色用的OsO 4 / K氰化钾溶液2小时，在4℃。
5. 冲洗在超纯水中三次，每次5分钟，并与TCH染色30分钟，在60℃。
6. 冲洗在超纯水中三次，每次5分钟，并染色以在室温60分钟2％OSO _4（不需K亚铁氰化物）。在超纯水中再漂洗三次，每次5分钟。
7. 染色用1％醋酸铀O / N在4℃。冲洗在超纯水中三次，每次5分钟。
8. 与染色在60℃铅天冬氨酸30分钟。冲洗在超纯水中三次，每次5分钟。
9. 通过在漂洗脱水搜索解决方案组织纳秒与增加的乙醇浓度。冲洗2次，每次5分钟，用50％，75％，85％，95％，和绝对的100％乙醇。在结束时，冲洗部分与环氧丙烷2次，每次10分钟。

在树脂7浸润和嵌入组织切片

1. 浸润块使用市售avaialble套件树脂。采用EPON嵌入工具包中的树脂嵌入组织。制备48％环氧，20％毫升DDSA，30％毫升NMA，和2％DMP30的树脂混合。搅动树脂混合物剧烈5分钟，然后将混合物在真空中进行30分钟，以允许气泡表面化。
2. 混合树脂，环氧丙烷在1:1的比例，大力摇晃。从组织中移除最终脱水漂洗，并添加树脂与环氧丙烷混合。地方小瓶在转子Ø采样/ N和离开瓶不封顶。第二天，添加新鲜的EPON树脂和混合90分钟在旋转器。
3. 嵌入块在树脂尽可能平坦夹着它们之间载玻片已固化液体分离剂，以防止它们粘在一起^15。
4. 一旦块被嵌入平面，固化该块的加成48小时，在60℃。
5. 拉滑动开以释放块。

8.安装和修整成像的组织块

1. 下解剖范围，匹配嵌入树脂的共焦显微照片，以方便识别修剪块之前包含感兴趣的细胞的区域中的组织块的方向。
2. 手动降到〜500×500微米的块面修剪树脂包埋块。
3. 安装块平放在含有导电环氧树脂干30分钟的脚。然后，躺在表面干燥O / N块持平，为60℃。
4. 大衣胶体银液块。保持组织切片平，以确保该块的切片以直角以促进共rrelating串行块面和共聚焦显微照片。

9. SBEM

1. 图像使用扫描电子显微镜配备有SBEM系统的块（例如.G。，3查看）。
2. 在〜2微米为单位设置的初始厚度部分，切，直到组织的脸上浮现从块。
3. 获得整个块面的surver图像。
4. 斐济使用软件，无论采取串行块面和共聚焦显微测量过程中固定和染色¹⁶来生成一个共同点，占样本翘曲。
5. 由分母乘以在共焦图象的坐标定位对块面感兴趣的区域。还可以使用其他的结构特征，如微绒毛，杯状细胞，或固有层的位置，作为参考。
6. 感兴趣的图像区域中的2.25千伏，在高真空模式为7nm /像素（或15,147X放大率）。切片增量应设置在70纳米或更低。
7. 收集原始16位.dm3格式SBEM数据。

对于曲面细分10 SBEM优化图像

1. 从原材料.dm3格式SBEM图像转换为8位.TIFF。
2. 过滤器使用.TIFF在斐济一个0.8高斯模糊滤镜图像。
3. 分频设置为原始大小的25％的数据，并将其保存为.TIFF栈，以尽量减少需要处理的一套RAM的内存量。
4. 使用对齐斐济插件"与SIFT线性栈对齐"的翻译模式SBEM图像的堆栈，并使用"裁剪3D"插件裁剪。注:裁切有助于进一步减少RAM存储器的必需的量用于分割和体绘制。

在3D渲染数据

11.共聚焦显微镜

1. 重建使用自动超越了"面"工具的模式Z-栈。 图1D，显示了一个REC使用上，该表面区域细节的平滑选项的每个信道的。施工在0.126微米，和阈值作为绝对强度。

12.串行块面部扫描电镜

注意:手动数据分割是耗时的过程并且根据要呈现的过程可能需要几个星期的特征的大量时间。分割为Bohórquez 等人提出的视频和数字2014 ⁸手工完成，花了大约500小时的劳动。建议优先的基本特征开始分割处理之前需要渲染。的步骤如下:

1. 用"表面"工具在绘制模式和"轮廓"选项在绘制的50毫秒模式手动段和体绘制的感兴趣的细胞。
2. 追踪细胞的每一片流畅的渲染或每5片更快的渲染上的轮廓。
3. 出口最终IM使用"快照"工具在300 dpi或以上的分辨率青睐。

结果

这里介绍的方法被用于研究特定细胞的超微结构的层上皮的范围内。在这种情况下，感兴趣的细胞是难以捉摸的肠内分泌细胞。其原位鉴定有可能仅在过去的几年中与细胞特异性荧光报告小鼠的发展。在2011年，我们开发了一种鼠标，其中激素PYY的启动子驱动的绿色荧光蛋白¹⁷的表达。在此PyyGFP鼠标，小肠和结肠的远侧部分的肠内分泌细胞在UV光下很容易区分。这种小鼠模型是一个基础，以确定含有肠内分泌细胞的组织块，并对其进行处理的SBEM。相关的方法在这里称为cocem3D，并建立在先前公布的协议^10,11。

优化组织块的尺寸是用于相关的关键。在初步实验中，它被确定在组织块300微米长×50μm厚SBEM图像的数目被减少到最低限度，同时覆盖所关注的细胞的整个身体。 图1A示出了夹层的俯视使用振动叶片microtrome到获得与权利尺寸的组织块。至少有100块是通过它们的排序挑那些感兴趣的完整细胞之前获得。所选块通过共聚焦显微镜和图像的z栈成像光学地间隔开，每1微米（ 图1B和C）。图1D示出了肠内分泌细胞在小鼠的回肠体积渲染视图。其突出neuropod延伸上皮细胞下为60〜微米。

感兴趣的细胞是通过关联的共焦的z栈与整个块面的SBEM图像发现。一个例子是从PyyGFP的远端结肠这里提出一个块的鼠标。获得共焦的z栈（ 图2A）以后，该块被嵌入到一个薄层低熔点琼脂糖（ 图2B）。这是必要的后续处理的块。它保持块尽可能平坦，以匹配该光学片与SBEM切片的取向是很重要的。在图2C中 ，一个代表性的图像示出了组织块的整个面的。以前发表的该图的部分被在Bohorquez 等人，2014年^8，这随后通过考虑组织的地标和尺寸相关的共聚焦图像。 图2D示出了该块的共焦和SBEM图像的重合，揭示了我们感兴趣的细胞的精确位置。

一旦细胞已被确定，SBEM成像完成时的分辨率足够高，以确定分泌囊泡和其他细胞器。该数据集介绍他重新进行成像以每像素为7nm作为该块的拍摄图像每70纳米。设置数据包含跨越45微米的组织深度643的图像。几微米的在整个块面的低倍率的初始成像剃光。原始SBEM数据集是在.dm3格式采集并转化为.TIFF进行后续处理。使用软件斐济插件"作物（3D）"块包含目的只有该地区SBEM堆栈被裁剪。这减少了所需要的体绘制的RAM存储器的量。该电池是由它的位置和分泌泡鉴定，并采用了Imaris软件分割。 图3包含了肠内分泌细胞的3D渲染。

图1:相关激光共聚焦显微镜（A）工作流程剖析了一块肠组织成一个组织块300×50微米厚。 （ 二）正确尺寸的代表组织块。需要注意的是从小鼠小肠这些尺寸的组织块跨越约3绒毛或，在结肠约8隐窝的情况。在包含感兴趣的细胞小肠（C）一个绒毛。 （D）的共焦Z堆叠使用了Imaris软件在3D渲染显示具有突出neuropod运行肠上皮下方的肠内分泌细胞。蓝= DAPI核染色。酒吧= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:串行块面部扫描电子显微镜（A）一塞莱的共聚焦图像。从含有目的PyyGFP肠内分泌细胞（绿色）的结肠反恐执行组织块。 （B）中一旦块被共焦显微镜成像，它随后将嵌入平板在低熔点琼脂糖用玻璃载片。嵌入在琼脂糖组织块便于后续处理，并且在左上角的切口有助于装入SBEM内的块中的右方向。 （C）的 SBEM图像块的脸部。与焦SBEM数据（D）的相关性来确定利率（白色箭头）的细胞。在c和d该图的图像从Bohorquez 等改性，2014 ^8。蓝色= DAPI核染色。酒吧= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:使用了Imaris软件肠内分泌细胞的数据呈现在3D（A）体积渲染。该单元格中包含挤满了分泌囊泡neuropod。对于肠内分泌细胞超微结构的完整描述，请参阅Bohórquez 等人 。2014年^8。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

胃肠chemosensation正在成为生物医学研究中的一个令人兴奋的新领域。这在很大程度上是由于功能性味觉受体在肠内分泌细胞¹⁸的发现。随后的研究已经表明，肠内分泌细胞表达特异受体为营养物质，包括碳水化合物，脂质和氨基酸^5,6,19,20。对于这些发现的催化因素是报告小鼠的发展，其中，肠内分泌细胞被荧光标记的^20。我们开发了这些小鼠中，PyyGFP鼠标，来研究远端小肠和结肠^17,21的肠内分泌细胞。这些细胞是感兴趣的，因为它们分泌PYY和胰高血糖素样肽1，这两者都是饱^22,23的诱导剂。当时，这些细胞的完整超结构帐户是缺少，我们认为这是必要的，了解他们的信令机制。

内容】">在这里，我们描述了一种在视觉上的方法，以消除共聚焦显微镜用SBEM。该方法被称为Cocem3D，这使我们能够记录肠内分泌细胞的完整超微结构。我们已经报道，这些细胞具有包含三一个neuropod四分之三的所有分泌囊泡⁸组成。内neuropod，有神经丝和很像神经轴突，neuropods由肠溶胶质细胞⁸培育出来的。更重要的是，它是尽管这些neuropods该肠内分泌细胞物理连接到神经元支配肠和结肠^9。

其中cocem3D的优势是它的简单。减小组织样本成可以通过共聚焦成像和SBEM便于组织内的特定细胞的识别的块。分泌囊泡和其它细胞器可以识别容易在为7nm /像素的分辨率。因为在SBEM的部分都将被丢弃，进一步PROCES唱组织，以确定特定的蛋白质是不在这一点上的选项。然而，方法如ATUM ^24，其中来自组织块部分被保留的发展，很可能使特定的蛋白质在细胞的识别。对肠内分泌细胞确定化学感受受体的具体位置是用于药物治疗肥胖的发展至关重要的信息，因为肠内分泌细胞是在大脑中的肠道和饱足感的食物之间的感官接口。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Life technologies	10010023
Heparin sodium salt	Sigma	H4784
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%, freshly made in PBS, final pH 7.4
Glutaraldehyde	Sigma	G5882
Dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Low-melting agarose	Life technologies	16520-100	5%, freshly made in PBS
Standard Tissue-Tek Cryomold	Electron Microscopy Sciences	62534-25
DAPI  nuclear stain	Life technologies	D1306
Postively charged glass slides and coverslips
Fine art paintbrush #1
Cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	11650
Tannic acid	Electron Microscopy Sciences	21700
EMbed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Liquid releasing agent	Electron Microscopy Sciences	70880
Liquid silver colloidal	Electron Microscopy Sciences	12630
CircuitWorks conductive epoxy	ITW Chemtronics	CW2400
Variable flow peristaltic pump	VWR	70730-064
VT1200S Vibrating blade microtome	Leica
Zeiss 780i confocal microscope	Carl Zeiss
Sigma VP Scanning Electron Microscope	Carl Zeiss
3view system	Gatan
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)		http://www.renovoneural.com	Renovo provides 3d EM services
Fiji software	Open access software
Computer station with 16 GB of RAM or more
Data visualization software Imaris 7.5	Bitplane