母体免疫激活诱导小鼠的病毒性模仿聚妊娠中期阶段（I:C）

摘要

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

摘要

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

引言

母体免疫激活（MIA）的概念从母体感染患有自闭症和精神分裂症¹的关联流行病学研究起源。由于没有在胎盘或母体病毒感染^2,3后胎儿大脑检测复制病毒病原体，感染的对后代的影响是假设由母体免疫系统的激活，而不是病原体本身引起的。

为了阐明MIA和精神障碍，注入化学合成，病毒模拟双链RNA聚肌苷之间的原因和结果关系:胞苷酸:成怀孕啮齿类动物（聚（I C））已被广泛地用作动物模型MIA ^4,5。聚（I:C）通过toll样受体3（TLR3），和聚的全身给药确认（I:C）诱导病毒样急性炎症反应。一种机制，通过它的聚（I:C）公关oduces行为异常和neuropathologies的后代是由母体胎盘胎儿轴⁶使亲和抗炎细胞因子的不平衡。一些研究小组已经通过在MIA模型理解精神障碍⁷的病因，并且由于研究组之间的不同的利益，免疫激活的不同时间点已被用来实现对脑发育和行为⁷不同扰动。

在保罗·帕特森实验室技术加州理工学院采用注射聚的策略（I:C）为孕鼠胚胎在12.5天（E12.5），它已经成功地证明了MIA能够诱导行为，神经的，并且在与自闭症和精神分裂症相关^8-11后代的免疫学变化。我们之前的工作表明，MIA后代显示行为异常（ 如社会impairmenT，通信逆差，重复的行为，焦虑样行为，以及潜在抑制赤字^{8,10,12），}免疫失调和细胞因子失衡^8,13,14，胎儿大脑的基因表达¹⁵的改变，在小叶第七浦肯野细胞的损失小脑^11，海马突触⁹性质改变，基因与环境互作^13，肠道通透性的改变，以及肠道菌群组成^16。此外，治疗和预防策略也从该模型系统^13,16,17的发展。通过在E12.5诱导MIA，其他人已经表明MIA产生脑突触分子¹⁷的胎儿胶质细胞活化和前脑基底胆碱能¹⁸发育改造，株特异性相互作用^19，大脑突触脑超微结构异常，脑线粒体呼吸链功能亢进abnormalties，下调，抑郁样行为，认知和海马长时程增强（LTP）障碍，与成人海马神经²⁰的赤字。

在这里，我们提供了如何通过聚诱导MIA在E12.5的详细方法（I:C），以及如何运用这一模型来研究自闭症和精神分裂症的病因学范式。要注意的是MIA为多种病症⁴的危险因素是很重要的，其结果是对时间和感应的方法，以及在怀孕水坝的饲养极为敏感。这样，实验室之间甚至轻微不一致常常导致低的再现性和/或后代不同的表型。我们的方法是专门为那些有兴趣在学习MIA为自闭症和精神分裂症的环境风险因素设计的，详细的描述中提供将有助于研究人员提高他们的数据的可重复性。

研究方案

所有协议均技术机构动物护理和使用委员会的加州理工学院（IACUC）的批准下进行的。

1.准备定时交配双

1. 使用基因表达分析至少6个水坝的行为实验和3。
   注意:使用估计雌性小鼠的双数，如只有50％左右的小鼠将从定时交配堵塞。
2. 使用雌性小鼠事先没有怀孕，并在8-16周龄。
   注:雌性小鼠有性行为之前接触到雄性小鼠但一直没怀孕是可以接受的。
3. 房子的雌性小鼠在一起并放置笼彼此相邻，以同步它们的动情周期。使用标准的小鼠笼的超过550英寸的高度和一个75平方英寸的室内地板，以允许5成年小鼠的外壳。标签使用耳朵打孔每个雌性小鼠。

2.设置定时垫ING对

1. 在暗循环开始前设置定时交配0-2小时。将两个雌性小鼠每个笼子。取出老鼠并单独衡量他们。记录体重每雌性小鼠。
2. 放置一个雄性小鼠与两个雌性小鼠每笼。使用三人配合以最小化父系混杂影响。

3.阴道塞检查（E0.5）

1. 检查雌性小鼠0-4小时黑暗循环结束后。轻轻抬起雌性小鼠从尾的基部，并允许小鼠抓住线栅，笼顶部，或笼边。
2. 搜索阴道塞的迹象:阴道塞在阴道口可见白色肿块。如果插头并不明显，轻轻插入200微升的枪头插入阴道口。从抗凝血证实阴道栓形成。检查阴道塞每天一次。
   注:阴道塞是只指示已发生交配，因此不克uarantee妊娠。阴道塞可能难以在小鼠中的某些菌株鉴别。求助有经验的护理人员小鼠增加的插件识别的准确性。
3. 移动插入小鼠到一个新的笼子和组安置他们。定义阴道塞的外观胚胎0.5天（E0.5）的日子。

4.在E10.5-11.5，检查是否怀孕

1. 轻轻提起尾巴的基部，并允许小鼠抓住线栅，笼顶部，或笼边。观察腹部区域以检查怀孕， 例如，在腹部的凸起（ 图1）的迹象。
   注意:怀孕的迹象总是在E11.5比E10.5更加明显。
2. 称量小鼠来验证怀孕。孕小鼠通常重达在E10.5重约20％，并在E12.5重30％相比，非妊娠小鼠（ 图2）。单家在清洁笼子里的孕鼠。

5. 20毫克/公斤的聚（I:C）的制备

1. 使用每组至少6水坝进行行为实验和3元组基因表达分析。制备多聚（I:C）的相应数量的解决方案。
2. 称量该聚（I:C）的粉末在50ml的锥形管，使40毫克/毫升的最终浓度。为了最小化和标准化引起的喷射量的应力，注入5微升的聚（I:C）对小鼠体重（5微升/克，或5毫升/公斤）每克溶液。为了诱导MIA，我们注入20毫克聚:每公斤（I C）。
   注:聚的浓度（I:C）所需的解决方案是（20毫克/千克）/（5毫升/公斤）= 4毫克/毫升。由于该聚（I:C）的粉末含有10％的聚（I:C），我们需要使（4毫克/毫升）/0.1= 40毫克/毫升的聚（I:C）的最终浓度溶液。
   警告:聚（I:C）粉末很轻。要小心，不要失去任何粉末，而从锅铲转移到锥形管。
3. 加0.9％氯化钠（盐水）相应体积成圆锥形桶e和盖上。直到解决方案是明确的:（C I）粉末通过在聚轻轻滚动滴生理盐水溶解的粉末。离心锥形管以800×g离心1分钟（ 图3C）。过滤聚（I:C）通过0.22微米的过滤器的解决方案。转移聚（I:C）溶液到1.5或2 ml离心管。可选:使用分光光度计来测量260/280比率的聚（I:C）的溶液中。确保该比率之间如制造商所描述1.54-1.82（ 图3）。注:（:C I）粉和作为对照注射应该是无菌的，药品级用于溶解聚生理盐水。

6.盐水或聚（I:C）的E12.5注射

1. 称重秤上的鼠标并把它放回笼子。使用下面的公式来计算注射的体积为盐水和聚（I:C）小鼠:体重量（g）乘以5 =所需注射量（微升）。使用0.3毫升INSUL在注射器制订盐水的计算的体积或20毫克/公斤的聚（I:C）的解决方案， 例如，150微升在30 G鼠标。
2. 由尾根部轻轻拿起小鼠，并将其放置在笼顶部。轻拿轻放鼠标，以避免应力引起的混杂影响。插入针头，斜面向上，在大约20°相对于小鼠成其两个上乳头（ 图4）的中心，并注入盐水或聚（I:C）的溶液。注:针应该更换为注射后每只小鼠。
3. 将鼠标返回到其家笼。将笼子在一个安静，低流量的房间，以避免其他混杂的效果。

7.聚后的第二天（I:C）注射（E13.5）

1. 检查以下早晨注射的小鼠。用规模来衡量体重。
   注:聚（I:C）注射的孕鼠通常体重增加少于注射生理盐水注射上后的第二天小鼠挠度。
2. 直到后代是天生的不打扰老鼠。

8.计MIA后代

1. 为了尽量减少MIA感应混杂影响，按照下面列出来衡量MIA后代的使用指南。
   1. 排除从窝早产或延迟生育，或者如果产仔数小于5。
   2. 安乐死的CO ₂的过度幼仔如果产仔大于10。

9.可选:检查急性炎症反应后MIA

1. 使用该机构的动物护理委员会批准的协议描述的方法注射:盐水或聚（C I）后牺牲孕鼠3小时。
   注:颈椎脱臼往往是首选，因为它最大限度地减少CO ₂ /安乐死药物对大坝和胚胎的影响。
2. 收集来自成年孕鼠脾脏和隔离胎盘和胎儿的胸罩在立体显微镜下。
   1. 对于脾虚收集，躺在解剖板鼠标和对孕鼠的腹部喷70％的乙醇。使用一对无菌剪刀，以使在腹部区域的胸腔下面通过皮肤中心的垂直切割。
   2. 脾坐在左上腹部象限。使用镊子脾隔离开来。滚上微妙的任务雨刷脾，除去周围器官的脂肪组织。收集大约50毫克的脾组织并单独放置在Eppendorf管500微升RNA稳定缓冲区或TRIzol试剂，以防止核酸降解。储存在-80℃下冷冻样品直至使用。
   3. 对于胎盘的收集，轻轻拔出从身体子宫角。放置子宫角在培养皿中填充有高压灭菌磷酸盐缓冲盐水（PBS），并离开在冰上的培养皿中。用两个镊子撕开子宫壁和揭露羊膜囊。
      1. 小心使用镊子打开羊膜囊不破坏胎盘和胎儿。分开胎儿胎盘和剪断脐带尽可能靠近胎盘越好。从胎盘中取出羊膜囊碎片。将胎盘分别在Eppendorf管500微升RNA稳定缓冲区或TRIzol试剂。储存在-80℃下冷冻直至使用的样本。
   4. 对于胎儿大脑的收集，储存在RNA从步骤9.2.2稳定缓冲区，直到解剖胎儿。从使用立体显微镜下微妙＃5镊子脑的脑室逗关闭软脑膜膜。小心地从胎儿大脑中删除所有的膜。将胎儿大脑单独在Eppendorf管500微升RNA稳定缓冲区或TRIzol试剂。储存在-80℃下冷冻直至使用的样本。
3. 提取从组织的RNA和该RNA转变为cDNA。通过实际-T分析了基因的IL6基因表达IME PCR。
4. 由以下的TRIzol的制造协议提取组织中的RNA。如果组织被存储在RNA稳定化缓冲液中。解冻样品和降速的缓冲区。通过尖端转移组织到另一个微量离心用500μl的TRIzol并继续RNA提取。
5. 使用分光光度计来测量浓度，260/280及260/230比率RNA的。确保比率是2.0以上。
6. 消除由处理用DNase一混合物1微克的RNA的RNA，1微升10X反应缓冲液，1微升RNA酶的DNase，和无核酸酶水的DNA污染到的10微升的最终体积。孵育在37℃的主混合物30分钟。加入1μl的DNA酶终止溶液以终止反应。孵育在65℃下该混合物10分钟。
7. 反向转录RNA为cDNA。使用20微升的反应，以及高达1微克每反应的总RNA。混合4微升5倍的逆转录（RT）反应混合物缓冲液，1微升转ERSE酶，用DNase I和4微升无核酸-H ₂ O处理后11微升RNA模板做出最后的20微升的解决方案。计划RT热循环的条件。一个通用的条件包括:第1步:25℃5分钟;步骤2:42℃30分钟;步骤3:85℃，5分钟;步骤4:保持在4℃。稀释的cDNA的5倍。对于短期储存，存放在4℃的基因。对于长期储存，冷冻在-20℃中的cDNA。
8. 分析中的cDNA通过实时PCR的IL6的基因表达和标准化IL6的基因表达对β-肌动蛋白基因的表达。
   1. 作出IL6和β-actin的检测预混液。使用25μl反应体系中，预混每个基因包含12.5微升的SYBR Green驴友，0.5微升10μM正向引物，0.5微升10μM反向引物和6.5微升无核酸酶的H ₂ O的
   2. 将5微升5倍稀释的cDNA一Ť光学96孔反应板的孔的底部。吸取20μl反应混合液，每孔作最后的25微升PCR混合物。一式三份各基因对于每个样品。使用光学胶膜封板。在800 xg离心在4℃下使用标准的程序的实时PCR的降速板3分钟:步骤1:50℃，2分钟;步骤2:95℃，10分钟;步骤3:15秒和温度60℃下1分钟的95℃的40个循环。添加解离曲线的附加步骤。

10.检查在MIA成年后代的行为异常（可选）:

1. 在8-12周的年龄进行行为测试。改变笼的床上用品在测试前至少3天。适应小鼠的行为测试室测试前至少30分钟。
2. 对前脉冲抑制（PPI），抑制在有机玻璃圆筒小鼠与它下方的压电传感器。适应小鼠的PPI腔室5分钟。暴露小鼠120分贝白噪声（惊吓）的6项研究。
3. 然后用15分贝（1​​5 dB的背景噪声的14项试验，惊吓的14项试验，预脉冲5分贝（比背景噪声高5 dB为单位）+惊吓（PPI5）的14项试验和预脉冲的14项试验的随机混合物暴露小鼠比背景噪声+惊吓（PPI15）。
4. 平均为120dB的试验的第6试验的惊恐反应。酒店的平均其他个别刺激的惊吓反应。隐蔽的值前脉冲抑制（惊吓 - PPI5或PPI15）/惊吓。
5. 对于开放式现场测试中，将鼠标在一个开放的广场舞台（50×50×50 ^立方厘米 ）的角落。通过一个安装在天花板上的相机拍摄的小鼠10分钟的轨迹。定义竞技场为中心区域（17×17 ^平方厘米）的中心。量化行进的距离，中心区的条目，并且时间在中心区手动或通过基于图像的自动分析软件花费。
6. 大理石埋藏测试，适应鼠标的测试笼压缩5厘米深，干净，阿斯松被褥10分钟。返回鼠标的居住笼。轻轻地放在20海军蓝直径1.5cm玻璃球中的4×5布置时尚。将鼠标回测试笼弹珠10分钟。算上已经被埋在10分钟的测试时间弹珠。

11.检查小脑的神经病理学成人MIA后代（可选）:

1. 通过安乐死麻醉的盐水和MIA成年子女。灌注通过心血管系统用50ml PBS鼠标和随后50毫升4％多聚甲醛。
2. 小心取出大脑，并于4过夜postfix的在4％低聚甲醛的脑 C。冲洗大脑用PBS三次，并在PBS中的脑用0.02％叠氮化钠储存在4℃冰箱中直至使用。
   注:后缀大脑可以存储在PBS中的0.02％草皮在冰箱IUM叠氮长达一个月。
3. 科脑入50微米的薄片矢状使用vibratome。收集用软毛笔的脑切片。通过温育在0.6％的过氧化氢的部分，在室温下30分钟终止该内源性过氧化物酶的活性。
4. 孵育在封闭缓冲液（在PBS中0.1％的Triton X-100和0.02％叠氮化钠的10％山羊血清）中稀释的抗钙结合蛋白抗体的部分在室温下过夜。然后孵育在对应于在室温下2小时封闭缓冲液稀释的生物素化的第二抗体的部分。
5. 孵育切片在抗生物素蛋白DH - 生物素化过氧化物酶H络合物缓冲器来检测生物素在室温下1小时。通过使用过氧化物酶底物以可视化的抗原开发的部分。中的步骤之间，用PBS洗涤切片三次。安装部分到显微镜载玻片。图像在显微镜下的章节。

结果

的20毫克/公斤的聚注射:在E12.5（I C）可以唤起在母体胎盘胎儿轴急性炎症反应并沉淀到大脑发育和行为表型^12,13慢性效果。一个促炎性细胞因子水平升高，白细胞介素（IL）-6，是MIA后急性炎症反应的可靠指标。高峰时间在胎盘IL6的基因表达和胎儿大脑是在3小时后的聚（I:C）注射^12,13。我们已经表明，聚（I:C）诱导整个脾脏产妇胎盘，胎儿的大脑...

讨论

MIA感应在不同的时间窗扰乱在啮齿类动物不同脑发育的事件，并因此导致在后代不同行为异常和neuropathologies。这里，我们描述了一种协议以诱导MIA小鼠与聚（I:C）在E12.5注射。 MIA感应的此方法导致行为，神经病学，免疫学，并与自闭症和精神分裂症的后代^8,10,11,16有关的胃肠道异常。要注意，这一点很重要，因为MIA是一个环境风险因素，它们的后代的表型，预计将有比来自神经发育障碍?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt	SIGMA	P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP	HOSPIRA	NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 mL 29G x 1/2"	COVIDIEN	8881600145
50 ml conical screw cap tubes	USA SCIENTIFIC	1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer	THERMO SCIENTIFIC	1000	Optional
Stereomicroscope	Wild Heerbrugg	M5A	Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06mm	Roboz	RS-5045	Optional
RNAlater RNA stabilization reagent	Qiagen	76104	Optional
TRIzol reagent	Life Technologies	15596-026	Optional
RQ1 Rnase-free DNase	Promega	M610A	Optional
iScript cDNA synthesis kit	Bio-Rad	170-8891	Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX	Roche	4913922001	Optional
Real-time PCR	ABI	7300	Optional
Primer: Il6 forward	Life Technologies	TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC	Optional
Primer: Il6 Reverse	Life Technologies	TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC	Optional
Primer: beta-actin forward	Life Technologies	AGAGGGAAATCGTGCGTGAC	Optional
Primer: beta-actin Reverse	Life Technologies	CAATAGTGATGACCTGGCCGT	Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate	Life Technologies	4306737	Optionl
MicroAmp optical adhesive film	Life Technologies	4311971	Optionl
EthoVision	Noldus	EthoVision	Optionl
SR-LAB apparatus (PPI)	San Diego Instruments	SR-LAB	Optionl
Marbles	PENN-PLAX	Blue gem stones marbles	Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21600-069	Optionl
Paraformaldehyde	MACRON	2621-59	Optionl
Vibratome	Leica	VT1000 S	Optionl
Sodium azide	Sigma	S2002	Optionl
Triton x-100	Sigma	X100	Optionl
Hydrogen peroxide solution	Sigma	18312	Optionl
Goat serum	Vector Laboratories	S-1000	Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody	Abcam	ab11426	Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody	Vector Laboratories	BA-1000	Optionl
VECTASTAIN ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000	Optionl