Induzione di materna immunitario attivazione nei topi a Mid-gestazione stage con Viral Mimic poli (I: C)

Riepilogo

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

Abstract

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Introduzione

Il concetto di attivazione immunitaria materna (MIA) proviene dagli studi epidemiologici sulla associazione tra infezione materna con autismo e la schizofrenia ^1. A causa dell'assenza di patogeni virali rilevabili replicanti nella placenta o cervello fetale dopo l'infezione virale materna ^2,3, l'effetto dell'infezione sulla prole è ipotizzato essere causato dalla attivazione del sistema immunitario materno piuttosto che i patogeni stessi .

Per chiarire il rapporto causa-effetto tra MIA e disturbi psichiatrici, l'iniezione di sintesi chimica, virale mimica doppio polyinosinic RNA incagliato: acido policitidilico (poli (I: C)) in roditori in gravidanza è stato ampiamente utilizzato come modello animale per MIA ^4,5. Poli (I: C) è riconosciuto da toll-like receptor 3 (TLR3), e la somministrazione sistemica di poli (I: C) induce risposta infiammatoria acuta virale simile. Uno dei meccanismi attraverso i quali poli (I: C) produces anomalie comportamentali e neuropatologie nella prole è causando uno squilibrio di citochine pro-infiammatorie e anti-nell'asse materno-placentare-fetale ^6. Diversi gruppi hanno adottato il modello MIA per comprendere l'eziologia dei disturbi psichiatrici ^7, ed a causa dei diversi interessi tra gruppi di ricerca, vari momenti di attivazione immunitaria sono stati utilizzati per ottenere diverse perturbazioni sullo sviluppo del cervello e comportamenti ^7.

Il laboratorio di Paul H. Patterson presso il California Institute of Technology adotta la strategia di iniezione di poli (I: C) in topi incinta a embrionali 12,5 giorni (E12.5), che ha dimostrato con successo che MIA è in grado di indurre comportamentale, neurologica, e cambiamenti immunologici nella prole che sono associati con l'autismo e la schizofrenia ^8-11. I nostri lavori precedenti mostrano che MIA prole visualizzare anomalie comportamentali (ad esempio, impairmen socialit, deficit di comunicazione, comportamento ripetitivo, comportamenti ansia-like, e latente deficit di inibizione ^8,10,12), immunitario disregolazione e citochine squilibrio ^8,13,14, alterazione del feto espressione genica del cervello ^15, la perdita di cellule di Purkinje nel lobo VII di cervelletto ^11, alterazione delle proprietà sinaptiche nell'ippocampo ^9, l'interazione gene x ambiente ^13, alterazione della permeabilità intestinale, intestino e la composizione del microbiota ^16. Inoltre, strategie terapeutiche e profilattiche sono anche sviluppati da questa ^13,16,17 sistema modello. Inducendo MIA a E12.5, altri hanno dimostrato che MIA produce attivazione della microglia fetale e colinergica alterazione dello sviluppo nel prosencefalo basale ^18, ceppo specifico interazione ^19, cervello sinaptosomiali cerebrale alterazioni ultrastrutturali, cerebrali respiratoria mitocondriale abnormalties catena iperfunzione, sottoregolazione di molecole sinaptosomiali cerebrali ¹⁷ ,comportamenti depressivi-like, compromissione della cognizione e ippocampo potenziamento a lungo termine (LTP) e deficit di adulti neurogenesi ippocampale ^20.

Qui, forniamo un metodo dettagliato di come indurre MIA a E12.5 da poli (I: C), così come paradigmi di come applicare questo modello per studiare l'eziologia di autismo e la schizofrenia. È importante notare che MIA è un fattore di rischio per una varietà di disturbi ^4, ed i suoi risultati sono estremamente sensibili al tempo e metodo di induzione e l'allevamento delle dighe in gravidanza. Come tale, anche incongruenze minori tra i laboratori spesso sfociano in bassa riproducibilità e / o differenti fenotipi nella prole. Il nostro metodo è specificamente progettato per chi è interessato a studiare MIA come un fattore di rischio ambientale per l'autismo e la schizofrenia, e la descrizione dettagliata fornita aiuterà i ricercatori a migliorare la riproducibilità dei dati.

Protocollo

Tutti i protocolli sono stati eseguiti sotto l'approvazione del California Institute of Technology Comitato cura e l'uso di animali Istituzionale (IACUC).

1. Preparazione per le coppie Timed-accoppiamento

1. Utilizzare almeno 6 dighe per esperimenti comportamentali e 3 per l'analisi di espressione genica.
   NOTA: utilizzare il doppio del numero di topi femmina stimato, in quanto solo il 50% dei topi verrà inserito dal temporizzata-accoppiamento.
2. Utilizzare topi di sesso femminile senza gravidanza prima e in 8-16 settimane di età.
   NOTA: i topi femmine che hanno esposizione sessuale prima di topi maschi, ma non sono stati in stato di gravidanza sono accettabili.
3. Casa topi femmine insieme e posizionare le gabbie accanto all'altro in modo da sincronizzare il loro ciclo estrale. Utilizzare una gabbia topi di serie con un'altezza di oltre 5,5 pollici e un pavimento interno 75 pollice quadrato per consentire abitazioni di 5 topi adulti. Etichettare ogni topo femmina con un pugno all'orecchio.

2. Impostazione Timed-matING coppia

1. Impostare il time-accoppiamento 0-2 ore prima dell'inizio del ciclo di buio. Inserire due topi di sesso femminile in ogni gabbia. Estrarre i topi e pesare individualmente. Registrare il peso corporeo di ogni topo femmina.
2. Posizionare un topo maschio in ogni gabbia con i due topi di sesso femminile. Utilizzare trio di accoppiamento per minimizzare l'effetto paterna confondimento.

3. Inserire vaginale Check (E0.5)

1. Controllare la femmina topi 0-4 ore dopo il ciclo di buio finisce. Sollevare delicatamente il mouse femminile dalla base della coda e lasciare il mouse per afferrare la griglia metallica, cima della gabbia, o il bordo della gabbia.
2. Ricerca di segni di spina vaginale: spina vaginale è una massa biancastra visibile in apertura vaginale. Se la spina non è evidente, inserire delicatamente un 200 microlitri punta della pipetta nell'apertura vaginale. La resistenza da coagulazione conferma la formazione spina vaginale. Controllare la spina vaginale una volta al giorno.
   NOTA: spina vaginale è solo una indicazione che si è verificato l'accoppiamento, e, pertanto, non gla gravidanza uarantee. spina vaginale può essere difficile da identificare in alcuni ceppi di topi. Cercare l'aiuto di un assistente topi con esperienza per aumentare la precisione dell'identificazione spina.
3. Spostare i topi collegati ad una nuova gabbia e raggrupparli House. Definire il giorno della vagina aspetto spina come embrionali 0,5 giorni (E0.5).

4. E10.5-11.5, Controllare per la gravidanza

1. Sollevare delicatamente la base della coda e lasciare il mouse per afferrare la griglia metallica, cima della gabbia, o il bordo della gabbia. Osservare zona addominale per verificare eventuali segni di gravidanza, ad esempio, un rigonfiamento nell'addome (Figura 1).
   NOTA: Il segno di gravidanza è sempre più evidente a E11.5 rispetto a E10.5.
2. Pesare i topi per verificare la gravidanza. Il mouse incinta generalmente pesa circa il 20% più pesante E10.5 e il 30% più pesante E12.5 rispetto ad un mouse non incinta (Figura 2). Casa singola topi incinta in gabbie pulite.

5. 20 mg /kg Poly (I: C) Preparazione

1. Utilizzare almeno 6 dighe per gruppo per esperimenti comportamentali e 3 per gruppo per l'analisi di espressione genica. Preparare la quantità corrispondente di poli (I: C) soluzione.
2. Pesare il poli (I: C) in polvere in una provetta conica da 50 ml per effettuare una concentrazione finale di 40 mg / ml. Al fine di minimizzare e standardizzare lo stress causato dal volume di iniezione, iniettare 5 ml di poli (I: C) soluzione per ogni grammo di peso corporeo mouse (5 ml / g, o 5 ml / kg). Per indurre MIA, iniettiamo 20 mg di poli (I: C) per kg.
   NOTA: La concentrazione di poli (I: C) soluzione necessaria è (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Poiché il poli (I: C) polvere contiene 10% di poli (I: C), è necessario effettuare una concentrazione finale di (I: C) (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml di poli soluzione.
   ATTENZIONE: Il poli (I: C) polvere è molto leggero. Fare attenzione a non perdere la polvere durante il trasferimento dalla spatola al tubo conico.
3. Aggiungere il volume corrispondente allo 0,9% di cloruro di sodio (soluzione fisiologica) nella vasca conicaE e chiudere il tappo. Sciogliere la polvere da dolci goccia salina sopra il poli (I: C) in polvere fino a quando la soluzione è chiara. Centrifugare la provetta conica a 800 xg per 1 min (Figura 3C). Filtrare la poly: soluzione di 0,22 micron filtro (I C). Trasferire la poli: soluzione (I C) per un tubo di 1,5 o 2 ml microcentrifuga. Opzionale: utilizzare uno spettrofotometro per misurare il rapporto 260/280 del poli (I: C) soluzione. Assicurarsi che il rapporto è tra 1,54-1,82 (Figura 3), come descritto dal produttore. NOTA: La salina utilizzata per dissolvere poli (I: C) in polvere e servire come iniezione di controllo dovrebbe essere di grado sterile e farmaceutica.

6. Saline o poli (I: C) Iniezione su E12.5

1. Pesare il mouse sulla scala e rimetterlo nella gabbia. Utilizzare la seguente formula per calcolare il volume di iniezione sia salina e poli (I: C) topi: peso (g) moltiplicato per 5 = volume di iniezione desiderato (microlitri). Utilizzare un isol 0,3 mlin siringa di redigere il volume calcolato di soluzione salina o 20 mg / kg poli (I: C) soluzione, ad esempio, 150 ml per un 30 g del mouse.
2. Delicatamente sollevare il mouse la base della coda e posizionarlo sulla parte superiore della gabbia. Maneggiare il mouse delicatamente per evitare effetti confondenti indotti da stress. Inserire l'ago, smussata, a circa 20 ° rispetto al mouse al centro dei due nippli superiori (Figura 4), ​​e iniettare il (I: C) salina o poli soluzione. NOTA: L'ago deve essere sostituito per ogni mouse dopo l'iniezione.
3. Posizionare il mouse alla sua gabbia casa. Mettere le gabbie in una tranquilla stanza basso traffico per evitare gli altri effetti confondenti.

7. The Day After poli (I: C) Injection (E13.5)

1. Controllare i topi iniettati la mattina seguente. Utilizzare una scala per misurare il peso corporeo.
   NOTA: Poli (I: C) iniettato topi in gravidanza di solito guadagnano meno peso rispetto salina iniettato topi il giorno dopo injessione.
2. Non disturbare i topi fino a quando la prole sono nati.

8. Calibro di MIA Offspring

1. Per ridurre al minimo gli effetti confondenti di MIA induzione, seguire le linee guida elencate di seguito per misurare l'utilizzo di MIA prole.
   1. Escludere le cucciolate da pretermine o la nascita in ritardo, o se la dimensione della cucciolata è più piccolo di 5.
   2. Euthanize i cuccioli eccessive di CO ₂ se la dimensione cucciolata è più grande di 10.

9. Opzionale: Esaminate la risposta infiammatoria acuta Dopo MIA

1. Sacrificare la gravidanza topi 3 ore dopo la salina o poli (I: C) di iniezione con il metodo descritto nel protocollo commissione ha approvato la cura degli animali dell'istituzione.
   NOTA: dislocazione cervicale è spesso preferito in quanto riduce al minimo l'effetto di CO ₂ farmaci / eutanasia sulla diga e dell'embrione.
2. Raccogliere la milza dai topi in gravidanza adulti e isolare la placenta e il reggiseno del fetoin con lo stereomicroscopio.
   1. Per la raccolta della milza, giaceva il mouse sulla piastra di dissezione e spruzzare il 70% di etanolo sulla zona addominale dei topi in gravidanza. Utilizzare un paio di forbici sterili per fare un taglio verticale al centro della zona addominale sotto la gabbia toracica attraverso la pelle.
   2. La milza si trova nella sinistra quadrante addominale superiore. Utilizzare pinze per isolare la milza. Stendere la milza su delicati tergicristalli compito di rimuovere il tessuto adiposo intorno l'organo. Raccogliere circa 50 mg di tessuto della milza e metterli singolarmente in tubi Eppendorf con 500 ml di RNA stabilizzare tampone o TRIzol per evitare la degradazione degli acidi nucleici. Conservare i campioni a -80 ° C freezer fino al momento dell'uso.
   3. Per la raccolta di placenta, estrarre delicatamente le corna uterine dal corpo. Collocare le corna uterine in una capsula di Petri riempita con fosfato salino autoclavato tamponata (PBS) e lasciare il piatto su ghiaccio. Utilizzare due pinze per strappare aperto la parete uterina ed esporre il sacco amniotico.
      1. usare con cautela le pinze per aprire il sacco amniotico senza danneggiare la placenta e il feto. Separare la placenta dal feto e tagliare il cordone ombelicale più vicino alla placenta possibile. Rimuovere i detriti sacco amniotico dalla placenta. Posizionare la placenta individualmente in tubi Eppendorf con 500 ml di RNA stabilizzano tampone o TRIzol. Conservare il campione a -80 ° C freezer fino al momento dell'uso.
   4. Per la raccolta cervello fetale, memorizzare il feto nel RNA stabilizzare tampone dal punto 9.2.2 fino dissezione. Tease fuori la membrana pial dal ventricolo del cervello utilizzando delicati # 5 pinze con lo stereomicroscopio. Rimuovere con attenzione tutto la membrana del cervello fetale. Posizionare il cervello del feto individualmente in tubi Eppendorf con 500 ml di RNA stabilizzano tampone o TRIzol. Conservare il campione a -80 ° C freezer fino al momento dell'uso.
3. Estrarre il RNA dal tessuto e convertire l'RNA a cDNA. Analizzare l'espressione del gene IL6 nel cDNA mediante real-time PCR.
4. Estrarre il RNA dai tessuti seguendo il protocollo di fabbricazione di TRIzol. Se i tessuti sono memorizzati nel buffer di stabilizzazione dell'RNA. Scongelare il campione e spin down del buffer. Trasferire il tessuto da punta ad un altro eppendorf con 500 microlitri TRIzol e continuare l'estrazione di RNA.
5. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione, 260/280 e 260/230 rapporto tra RNA. Assicurarsi che i rapporti sono al di sopra 2.0.
6. Eliminare la contaminazione del DNA dai trattati RNA con DNasi I. Mix RNA 1 mg, 1 microlitri 10X tampone di reazione, 1 ml RNase-Free DNase e acqua priva di nucleasi ad un volume finale di 10 pl. Incubare la master mix a 37 ° C per 30 min. Aggiungere 1 soluzione di stop DNasi microlitri di interrompere la reazione. Incubare la miscela a 65 ° C per 10 min.
7. Reverse trascrivere l'RNA a cDNA. Utilizzare 20 reazioni microlitri, e fino a 1 mg di RNA totale per reazione. Mix 4 microlitri 5x invertire buffer di trascrizione (RT) mix di reazione, 1 ml revERSE trascrittasi, 11 stampo di RNA ml dopo il trattamento con DNasi I e 4 microlitri priva di nucleasi H ₂ O per ottenere una soluzione finale di 20 ml. Programmare le condizioni termociclatore per RT. Una condizione generica includono: Fase 1: 25 ° C per 5 minuti; Fase 2: 42 ° C per 30 min; Fase 3: 85 ° C per 5 min; Fase 4: tenere a 4 ° C. Diluire il cDNA 5 volte. Per la conservazione a breve termine, conservare il cDNA a 4 ° C. Per la conservazione a lungo termine, congelare il cDNA a -20 ° C.
8. Analizzare l'espressione del gene IL6 nel cDNA mediante real-time PCR e normalizzare l'espressione del gene IL6 di beta-actina espressione genica.
   1. Fare un master mix per IL-6 e la rilevazione β-actina. Utilizzare 25 microlitri reazione, il master mix per ogni gene include 12,5 ml SYBR Green Mix, 0,5 l di 10 micron di primer in avanti, 0,5 l di 10 micron di primer inverso e 6,5 microlitri priva di nucleasi H ₂ O.
   2. Mettere 5 ml 5x diluito cDNA unt il fondo del pozzetto della piastra ottica reazione 96 pozzetti. Pipettare 20 ml di master mix per ogni bene per fare un finale di 25 microlitri PCR mix. Triplicato ogni gene per ogni campione. Sigillare la piastra utilizzando pellicola adesiva ottica. Centrifugare la piastra a 800 xg per 3 min a 4 ° C Utilizzare il programma standard di PCR in tempo reale: Fase 1: 50 ° C per 2 min; Fase 2: 95 ° C per 10 min; Fase 3: 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min. Aggiungere un ulteriore passo per la curva di dissociazione.

10. esaminare le anomalie comportamentali nella prole MIA adulti (opzionale):

1. Eseguire i test di comportamento all'età di 8-12 settimane. Cambiare la biancheria da letto gabbia almeno 3 giorni prima della prova. Acclimatare i topi alla sala test comportamentali almeno 30 minuti prima del test.
2. Per prepulse inibizione (PPI), trattiene i topi nel cilindro plexiglass con un sensore piezoelettrico sotto. Acclimatare i topi al PPIcamera per 5 min. Esporre i topi con 6 prove di 120 dB rumore bianco (startle).
3. Poi esporre i topi con miscele randomizzati di 14 studi di rumore di fondo, 14 studi di Startle, 14 studi su prepulse 5 dB (5 dB più alto del rumore di fondo) + Startle (PPI5), e 14 studi di prepulse 15 dB (15 dB più alti di rumore di fondo + Startle (PPI15).
4. In media il risposte di allarme per i primi 6 prove di 120 prove dB. In media il risposte di allarme per gli altri stimoli individuali. Covert il valore di inibizione prepulse da (Startle - PPI5 o PPI15) / Startle.
5. Per la prova campo aperto, posizionare il mouse in un angolo di un'arena piazza aperta (50 x 50 x 50 cm ^3). Registrare la traiettoria del mouse per 10 min attraverso una telecamera soffitto. Definire il centro dell'arena come la zona centrale (17 x 17 cm ^2). Quantificare la distanza percorsa, le voci zona centrale, e il tempo trascorso in zona centrale manualmente o basato su immagini software di analisi automatica.
6. Per la prova sepoltura di marmo, acclimatare il mouse in una gabbia di prova con profondo, pulito, Aspen biancheria da letto di pino 5 centimetri compressa per 10 min. Ritorna il mouse per la sua homecage. Posizionare delicatamente 20 blu navy 1,5 cm biglie di vetro del diametro nel campo della moda di 4 x 5 Trattamento. Posizionare il mouse avanti alla gabbia test con marmi per 10 min. Contare i marmi che è stato sepolto nella durata test 10 min.

11. Esaminare il cerebellare Neuropatologia nella prole MIA adulti (opzionale):

1. Euthanize la soluzione salina e MIA figli adulti da anestetico. Profumato il mouse con 50 ml di PBS e successivamente 50 ml 4% paraformaldeide attraverso il sistema cardiovascolare.
2. Rimuovere accuratamente il cervello e postfix il cervello in 4% paraformaldeide notte a 4 ° C. Risciacquare il cervello con PBS per tre volte e memorizzare il cervello in PBS con sodio azide 0,02% in C frigorifero 4 ° fino al momento dell'uso.
   NOTA: Il cervello postfissati può essere memorizzato in PBS con 0,02% SODazide IUM in frigorifero per un massimo di un mese.
3. Sezione del cervello in 50 micron fette sottili sagittalmente utilizzando vibratome. Raccogliere le sezioni di cervello utilizzando una penna spazzola morbida. Terminare l'attività perossidasica endogena incubando le sezioni di perossido di idrogeno 0,6% per 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Incubare le sezioni in anticorpo anti-calbindin diluito nel tampone di bloccaggio (siero di capra 10% con 0,1% Triton X-100 e 0,02% di sodio azide in PBS) per una notte a temperatura ambiente. Incubare le sezioni in corrispondenti biotinilato anticorpo secondario diluito in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente.
5. Incubare le sezioni in DH avidina - biotinilato perossidasi tampone complesso H per rilevare la biotina per 1 ora a temperatura ambiente. Sviluppare sezioni utilizzando substrato della perossidasi per visualizzare l'antigene. Lavare le sezioni con PBS per tre volte tra i gradini. Montare le sezioni su vetrini da microscopio. Immagine sezioni sotto il microscopio.

Risultati

L'iniezione di 20 mg / kg poli (I: C) a E12.5 potrebbe evocare una risposta infiammatoria acuta nell'asse materno-placentare-fetale e precipitare un effetto cronica allo sviluppo del cervello e fenotipi comportamentali ^12,13. Elevati livelli di citochine proinfiammatorie una, interleuchina (IL) -6, è un indicatore affidabile della risposta infiammatoria acuta dopo MIA. Il momento di picco per IL6 espressione genica nella placenta e nel cervello del feto...

Discussione

MIA induzione a differenti finestre temporali perturba diversi eventi di sviluppo del cervello nei roditori, e di conseguenza porta a diverse anomalie comportamentali e neuropatologie nella prole. Qui, abbiamo descritto un protocollo per indurre MIA nei topi con poli (I: C) iniezione E12.5. Questo metodo di MIA induzione porta a comportamentale, neurologiche, immunologiche, e le anomalie gastrointestinali associati con l'autismo e la schizofrenia nella prole ^8,10,11,16. È importante notare che, a causa M...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt	SIGMA	P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP	HOSPIRA	NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 mL 29G x 1/2"	COVIDIEN	8881600145
50 ml conical screw cap tubes	USA SCIENTIFIC	1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer	THERMO SCIENTIFIC	1000	Optional
Stereomicroscope	Wild Heerbrugg	M5A	Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06mm	Roboz	RS-5045	Optional
RNAlater RNA stabilization reagent	Qiagen	76104	Optional
TRIzol reagent	Life Technologies	15596-026	Optional
RQ1 Rnase-free DNase	Promega	M610A	Optional
iScript cDNA synthesis kit	Bio-Rad	170-8891	Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX	Roche	4913922001	Optional
Real-time PCR	ABI	7300	Optional
Primer: Il6 forward	Life Technologies	TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC	Optional
Primer: Il6 Reverse	Life Technologies	TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC	Optional
Primer: beta-actin forward	Life Technologies	AGAGGGAAATCGTGCGTGAC	Optional
Primer: beta-actin Reverse	Life Technologies	CAATAGTGATGACCTGGCCGT	Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate	Life Technologies	4306737	Optionl
MicroAmp optical adhesive film	Life Technologies	4311971	Optionl
EthoVision	Noldus	EthoVision	Optionl
SR-LAB apparatus (PPI)	San Diego Instruments	SR-LAB	Optionl
Marbles	PENN-PLAX	Blue gem stones marbles	Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21600-069	Optionl
Paraformaldehyde	MACRON	2621-59	Optionl
Vibratome	Leica	VT1000 S	Optionl
Sodium azide	Sigma	S2002	Optionl
Triton x-100	Sigma	X100	Optionl
Hydrogen peroxide solution	Sigma	18312	Optionl
Goat serum	Vector Laboratories	S-1000	Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody	Abcam	ab11426	Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody	Vector Laboratories	BA-1000	Optionl
VECTASTAIN ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000	Optionl