La inducción de la activación inmune materna en ratones en la etapa mitad de la gestación con Viral Mimic poli (I: C)

Resumen

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

Resumen

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Introducción

El concepto de la activación inmune materna (MIA) se origina a partir de los estudios epidemiológicos sobre la asociación de la infección materna con el autismo y la esquizofrenia ^1. Debido a la ausencia de patógenos virales de replicación detectables en la placenta o el cerebro del feto después de la infección viral de la madre ^2,3, el efecto de la infección en la descendencia es la hipótesis de que es causada por la activación del sistema inmune materno en lugar de los propios patógenos .

Para dilucidar la relación causa-efecto entre MIA y los trastornos psiquiátricos, la inyección de sintetizado químicamente, virales imitan doble poliinosínico ARN de cadena: ácido policitidílico (poli (I: C)) en roedores embarazadas ha sido ampliamente utilizado como modelo animal para el MIA ^4,5. Poli (I: C) es reconocida por los receptores Toll-like 3 (TLR3), y la administración sistémica de poli (I: C) induce la respuesta inflamatoria aguda de tipo vírico. Uno de los mecanismos por los que el poli (I: C) produces anomalías conductuales y neuropatologías en la descendencia es al causar un desequilibrio de las citocinas inflamatorias favor y en contra en el eje materno-fetal de la ^placenta-6. Varios grupos han adoptado el modelo de MIA de entender la etiología de los trastornos psiquiátricos ^7, y debido a la diversidad de intereses entre grupos de investigación, varios puntos de tiempo de la activación inmune se han utilizado para conseguir diferentes perturbaciones en el desarrollo del cerebro y los comportamientos ^7.

El laboratorio de Paul H. Patterson en el Instituto de Tecnología de California adopta la estrategia de inyección de poli (I: C) en ratones embarazadas en embriones de 12,5 días (E12.5), que ha demostrado con éxito que MIA es capaz de inducir comportamiento, neurológicos, y cambios inmunológicos en la descendencia que están asociados con el autismo y la esquizofrenia ^8-11. Nuestros trabajos anteriores muestran que MIA descendencia mostrar anormalidades de comportamiento (por ejemplo, impairmen socialest, déficit de comunicación, comportamiento repetitivo, un comportamiento similar a la ansiedad, y la inhibición latente déficit ^8,10,12), la desregulación inmune y citocinas desequilibrio ^8,13,14, alteración de la expresión de genes del cerebro fetal al ^15, la pérdida de células de Purkinje en el lóbulo VII del cerebelo ^11, alteración de las propiedades sinápticas en el hipocampo ^9, la interacción gen x ambiente ^13, la alteración de la permeabilidad del intestino, y la composición de la microbiota intestinal ^16. Además, las estrategias terapéuticas y profilácticas también se desarrollan a partir de este ^13,16,17 sistema modelo. Mediante la inducción de MIA en E12.5, otros han demostrado que MIA produce la activación microglial fetal y alteración del desarrollo colinérgica en el cerebro anterior basal ^18, la interacción cepa específica ^19, cerebro sinaptosomales cerebral anomalías ultraestructurales, cerebrales mitocondriales respiratorias abnormalties hiperfunción cadena, regulación a la baja de moléculas sinaptosomales cerebrales ¹⁷ ,comportamientos de tipo depresivo, deterioro en la cognición y del hipocampo potenciación a largo plazo (LTP), y el déficit de la neurogénesis del hipocampo adulto ^20.

Aquí, se proporciona un método detallado de cómo inducir MIA en E12.5 por poli (I: C), así como paradigmas de cómo aplicar este modelo para estudiar la etiología de autismo y la esquizofrenia. Es importante señalar que MIA es un factor de riesgo para una variedad de trastornos ^4, y sus resultados son extremadamente sensibles a la hora y el método de inducción, así como la cría de las presas embarazadas. Como tal, incluso pequeñas incongruencias entre los laboratorios a menudo resultan en una baja reproducibilidad y / o diferentes fenotipos en la descendencia. Nuestro método está diseñado específicamente para los interesados ​​en el estudio de MIA como un factor de riesgo ambiental para el autismo y la esquizofrenia, y la descripción detallada proporcionada ayudará a los investigadores a mejorar la reproducibilidad de sus datos.

Protocolo

Todos los protocolos se realizaron bajo la aprobación del California Institute of Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Tecnología (IACUC).

1. Preparación de pares de temporizado de apareamiento

1. Use por lo menos 6 presas para los experimentos de comportamiento y 3 para el análisis de la expresión génica.
   NOTA: Utilice el doble del número de ratones hembras estimados, ya que sólo alrededor del 50% de los ratones se conecta desde la cronometrada de apareamiento.
2. Utilice ratones femenino sin embarazo antes y en 8-16 semanas de edad.
   NOTA: Los ratones hembra que tiene la exposición sexual antes de los ratones machos, pero no han estado embarazadas son aceptables.
3. Casa los ratones hembra juntos y coloque las jaulas junto a la otra con el fin de sincronizar su ciclo estral. Utilice una jaula de ratones estándar con una altura de más de 5,5 pulgadas y un piso interior 75 pulgada cuadrada para permitir la vivienda de 5 ratones adultos. Etiqueta de cada ratón hembra usando un punzón oreja.

2. La creación de temporizado-matING Par

1. Configurar el cronometrado de apareamiento 0-2 horas antes de que comience el ciclo de oscuridad. Coloque dos ratones hembra en cada jaula. Sacar los ratones y pesarlos individualmente. Anotar el peso corporal de cada ratón hembra.
2. Coloque un ratón macho en cada jaula con los dos ratones hembra. Utilice el apareamiento trío para minimizar el efecto de confusión paterna.

3. Comprobar tapón vaginal (E0.5)

1. Compruebe la hembra ratones 0-4 horas después de que termine el ciclo de oscuridad. Levante con cuidado el ratón hembra de la base de la cola y permitir que el ratón para coger la rejilla de alambre, la parte superior de la jaula, o el borde de la jaula.
2. La búsqueda de signos de tapón vaginal: tapón vaginal es una masa blanquecina visible en la abertura vaginal. Si el enchufe no es evidente, introduzca suavemente una punta de pipeta de 200 l en la abertura vaginal. La resistencia de la coagulación confirma la formación del tapón vaginal. Compruebe el tapón vaginal una vez al día.
   NOTA: tapón vaginal sólo es una indicación de que se ha producido la copulación, y por lo tanto no guarantee el embarazo. tapón vaginal puede ser difícil de identificar en ciertas cepas de ratones. Busque la ayuda de un cuidador ratones con experiencia para aumentar la precisión de la identificación de enchufe.
3. Mover los ratones conectados a una nueva jaula y el grupo de vivienda para ellos. Definir el día de la aparición tapón vaginal como embrionarias 0,5 días (E0.5).

4. En E10.5-11.5, verificar si está embarazada

1. levante suavemente la base de la cola y permitir que el ratón para coger la rejilla de alambre, la parte superior de la jaula, o el borde de la jaula. Observe el área del abdomen para verificar si hay signos de embarazo, por ejemplo, una protuberancia en el abdomen (Figura 1).
   NOTA: El signo de embarazo es siempre más evidente que en E11.5 en E10.5.
2. Pesar los ratones para verificar el embarazo. El ratón embarazadas generalmente pesa alrededor de 20% más pesado en E10.5 y un 30% más pesado en E12.5 en comparación con un ratón que no está embarazada (Figura 2). Sola casa los ratones embarazadas en jaulas limpias.

5. 20 mg /kg de poli (I: C) Preparación

1. Use por lo menos 6 presas por grupo para los experimentos de comportamiento y 3 por grupo para el análisis de la expresión génica. Preparar la cantidad correspondiente de poli (I: C) solución.
2. Pesar el poli (I: C) en polvo en un tubo cónico de 50 ml para hacer una concentración final de 40 mg / ml. Con el fin de minimizar y estandarizar el estrés causado por el volumen de inyección, inyectar 5 l de poli (I: C) solución para cada gramo de peso corporal de ratón (5 l / g, o 5 ml / kg). Para inducir la MIA, inyectamos 20 mg de poli (I: C) por kg.
   NOTA: La concentración de poli (I: C) solución necesaria es (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Puesto que el poli (I: C) polvo contiene 10% de poli (I: C), tenemos que hacer una concentración final de (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml de poli (I: C) solución.
   PRECAUCIÓN: El poli (I: C) en polvo es muy ligero. Tenga cuidado de no perder ninguna de polvo durante la transferencia de la espátula para el tubo cónico.
3. Añadir el volumen correspondiente de cloruro de sodio 0,9% (solución salina) en la bañera cónicae y cerrar la tapa. Disolver el polvo rodando suavemente la gota de solución salina sobre el poli (I: C) en polvo hasta que la solución es clara. Centrifugar el tubo cónico a 800 xg durante 1 min (Figura 3C). Filtrar el poli (I: C) solución por 0,22 micras filtro. Transferir el poli (I: C) solución a un tubo de 1,5 o 2 ml de microcentrífuga. Opcional: Utilice un espectrofotómetro para medir la relación 260/280 de la poli (I: C) solución. Asegúrese de que la relación es de entre 1,54 a 1,82 (Figura 3) como se describe por el fabricante. NOTA: La solución salina utilizado para disolver el poli (I: C) en polvo y servir como control de la inyección debe ser de grado estéril y farmacéutica.

6. Saline o poli (I: C) Inyección en E12.5

1. Pesar el ratón sobre la escala y ponerlo de nuevo en la jaula. Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen de la inyección tanto para la solución salina y poli (I: C) ratones: el peso corporal (g) multiplicado por 5 = volumen de inyección deseado (l). Use un Insul 0,3 mlen la jeringa para extraer el volumen calculado de solución salina o 20 mg / kg de poli (I: C) solución, por ejemplo, 150 ml para un ratón de 30 g.
2. recoger suavemente hacia arriba el ratón por la base de la cola y colocarlo en la parte superior de la jaula. Manejar el ratón con cuidado para evitar confusión efectos inducidos por el estrés. Insertar la aguja, bisel hacia arriba, aproximadamente a 20 ° en relación con el ratón en el centro de sus dos pezones superior (Figura 4), ​​e inyectar la solución salina o poli (I: C) solución. NOTA: La aguja debe ser reemplazado para cada ratón después de la inyección.
3. Coloque el ratón de nuevo a su jaula. Colocar las jaulas en una habitación tranquila tráfico, baja para evitar los efectos de confusión de otros.

7. El día de poli (I: C) Inyección (E13.5)

1. Compruebe los ratones inyectados a la mañana siguiente. Utilice una escala para medir el peso corporal.
   NOTA: El poli (I: C) inyectado ratones embarazadas por lo general ganan menos peso que los ratones solución salina inyectada en el día después injexión.
2. No moleste a los ratones hasta que nacen las crías.

8. Captador de la MIA Offspring

1. Con el fin de minimizar los efectos de confusión de la inducción MIA, sigue las instrucciones que figuran a continuación para medir el uso de MIA descendencia.
   1. Excluir las camadas de nacimiento prematuro o tardío, o si el tamaño de la camada es menor que 5.
   2. La eutanasia de los cachorros excesivas de _CO2 si el tamaño de la camada es mayor que 10.

9. Opcional: Examine la respuesta inflamatoria aguda Después de MIA

1. Sacrificar el embarazo los ratones 3 horas después de la solución salina o poli (I: C) de inyección utilizando el método descrito en el protocolo aprobado por comité de cuidado de los animales de la institución.
   NOTA: La dislocación cervical a menudo se prefiere ya que minimiza el efecto de las drogas de CO ₂ / eutanasia en la presa y el embrión.
2. Se recoge el bazo de los ratones gestantes adultas y aislar la placenta y el feto sujetadoren menos del microscopio estereoscópico.
   1. Para la recolección de bazo, poner el ratón sobre la placa de disección y rociar 70% de etanol en la zona abdominal de los ratones embarazadas. Use un par de tijeras estériles para hacer un corte vertical en el centro de la zona abdominal por debajo de la caja torácica a través de la piel.
   2. El bazo se encuentra en el cuadrante abdominal superior, izquierda. El uso de fórceps para aislar el bazo. Enrollar el bazo de limpiaparabrisas tarea delicada para eliminar el tejido graso alrededor del órgano. Recoger aproximadamente 50 mg de tejido esplénico y colocarlos individualmente en tubos Eppendorf con 500 l de ARN estabilizar tampón o TRIzol para evitar la degradación de ácidos nucleicos. Almacenar las muestras a -80 ° C congelador hasta su uso.
   3. Para la recolección de la placenta, tire suavemente de los cuernos uterinos del cuerpo. Coloque los cuernos uterinos en una placa de Petri llena de solución salina de fosfato tamponada esterilizada en autoclave (PBS) y dejar el plato en hielo. Use dos pinzas para rasgar la pared uterina y exponer el saco amniótico.
      1. Con cuidado, usar las pinzas para abrir el saco amniótico sin dañar la placenta y el feto. Separar la placenta del feto y cortar el cordón umbilical tan cerca de la placenta como sea posible. Eliminar los restos saco amniótico de la placenta. Coloque la placenta individualmente en tubos Eppendorf con 500 l de ARN estabilizan tampón o TRIzol. Conservar la muestra a -80 ° C congelador hasta su uso.
   4. Para la recolección de cerebro fetal, almacenar el feto en el ARN a estabilizar tampón de la etapa 9.2.2 hasta la disección. Se burlan de la membrana pial desde el ventrículo del cerebro utilizando delicados # 5 fórceps bajo el microscopio estereoscópico. Retirar con cuidado toda la membrana del cerebro del feto. Coloque los cerebros fetales individualmente en tubos Eppendorf con 500 l de ARN estabilizan tampón o TRIzol. Conservar la muestra a -80 ° C congelador hasta su uso.
3. Extraer el ARN a partir del tejido y convertir el ARN en ADNc. Analizar la expresión del gen IL-6 en el ADNc de real-time PCR.
4. Extraer el ARN de los tejidos siguiendo el protocolo fabricación de TRIzol. Si los tejidos se almacenan en tampón de estabilización de ARN. Descongelar la muestra y centrifugar la memoria intermedia. Transferir el tejido de punta a otra Eppendorf con 500 l TRIzol y continuar la extracción de RNA.
5. Use un espectrofotómetro para medir la concentración, 260/280 y 260/230 relación del ARN. Asegúrese de que las relaciones son por encima de 2,0.
6. Eliminar la contaminación de ADN por tratado el ARN con ADNasa I. Mix RNA 1 g, tampón de reacción de 1 l 10X, 1 l de DNasa libre de RNasa, y agua libre de nucleasa a un volumen final de 10 l. Incubar la mezcla maestra a 37 ° C durante 30 min. Añadir 1 l de solución de parada DNasa para terminar la reacción. Incubar la mezcla a 65 ° C durante 10 min.
7. Transcripción inversa del ARN en ADNc. Utilice reacciones de 20 l, y de hasta 1 g de ARN total por reacción. Mezclar 4 l de tampón de transcripción (RT) de la mezcla de reacción 5x revertir, 1 l reverse transcriptasa, 11 l plantilla de ARN después del tratamiento con DNasa I y 4 l de nucleasa libre de _H2O para obtener una solución final de 20 microlitros. Programar las condiciones termociclador para RT. Una condición genérico incluye: Paso 1: 25 ° C durante 5 min; Paso 2: 42 ° C durante 30 min; Paso 3: 85 ° C durante 5 min; Paso 4: mantener a 4 ° C. Diluir el cDNA 5 veces. Para el almacenamiento a corto plazo, almacenar el ADNc a 4 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, congelar el cDNA a -20 ° C.
8. Analizar la expresión del gen IL6 en el ADNc mediante PCR en tiempo real y normalizar la expresión del gen IL6 a ß-actina de la expresión génica.
   1. Hacer una mezcla maestra para la IL-6 y la detección de β-actina. Utilice 25 l de reacción, la mezcla maestra para cada gen incluye 12,5 l SYBR Green Mix, 0,5 l de cebador directo 10 M, 0,5 l de 10 mM cebador inverso y 6,5 l de nucleasa libre de H ₂ O.
   2. Coloca 5 l 5x ADNc diluida unat el fondo del pozo de placa de reacción óptica de 96 pocillos. Pipetear 20 l de mezcla maestra a cada pocillo para hacer un 25 l final de mezcla de PCR. Por triplicado cada gen para cada muestra. Sellar la placa con película adhesiva óptica. Centrifugar la placa a 800 xg durante 3 min a 4 ° C Utilice el programa estándar de PCR en tiempo real: Paso 1: 50 ° C durante 2 min; Paso 2: 95 ° C durante 10 min; Paso 3: 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y la temperatura de 60 ° C durante 1 min. Añadir un paso adicional para la curva de disociación.

10. Examine las anormalidades de comportamiento en Offspring MIA adulto (Opcional):

1. Llevar a cabo las pruebas de comportamiento en las edades de 8-12 semanas. Cambiar la ropa de cama jaula de al menos 3 días antes de la prueba. Aclimatarse a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento al menos 30 minutos antes de la prueba.
2. Para la inhibición prepulso (PPI), restringir los ratones en cilindros de plexiglás con un sensor piezoeléctrico por debajo de ella. Aclimatarse a los ratones a la PPIcámara de 5 min. Exponer a los ratones con 6 ensayos de 120 dB de ruido blanco (sobresalto).
3. A continuación, exponer a los ratones con mezclas aleatorias de 14 ensayos de ruido de fondo, 14 ensayos de sobresalto, 14 ensayos de prepulso 5 dB (5 dB mayor que el ruido de fondo) + sobresalto (PPI5), y 14 ensayos de prepulso 15 dB (15 dB más altos de ruido de fondo + de sobresalto (PPI15).
4. Promediar la respuesta de sobresalto durante los 6 primeros ensayos de 120 ensayos dB. Promediar la respuesta de sobresalto para los otros estímulos individuales. Convertir el valor a la inhibición prepulso por (sobresalto - PPI5 o PPI15) / sobresalto.
5. Para la prueba de campo abierto, coloque el puntero del ratón en la esquina de un espacio cuadrado abierto (50 x 50 x 50 cm ^3). Registrar la trayectoria del ratón durante 10 min a través de una cámara montada techo. Definir el centro de la arena como la zona central (17 x 17 cm ^2). Cuantificar la distancia recorrida, las entradas de la zona central, y el tiempo transcurrido en la zona central de forma manual o mediante software de análisis automático basado en imágenes.
6. Para la prueba de enterramiento de esferas, ambientar el ratón a una jaula de ensayo con, limpio, ropa de cama de pino Aspen profundidad de 5 cm comprimido durante 10 minutos. Vuelva a colocar el puntero del ratón a su homecage. Con cuidado, coloque 20 de color azul marino de 1,5 cm de diámetro canicas de vidrio en la moda de 4 x 5 arreglo. Coloque el ratón de nuevo a la jaula de ensayo con mármoles durante 10 minutos. Contar los mármoles que ha sido enterrados en la duración del ensayo de 10 min.

11. Examine el cerebelosa Neuropatología en la descendencia MIA Adultos (Opcional):

1. La eutanasia a la solución salina y MIA hijos adultos por anestesia. Perfundir el ratón con 50 ml de PBS y posteriormente 50 ml de paraformaldehído al 4% a través del sistema cardiovascular.
2. Retire cuidadosamente el cerebro y Postfix el cerebro en 4% de paraformaldehído durante la noche a 4 DO. Enjuague el cerebro con PBS tres veces y almacenar el cerebro en PBS con azida de sodio 0,02% en una nevera C 4 ° hasta su uso.
   NOTA: El cerebro se fijaron posteriormente se puede almacenar en PBS con 0,02% de SODazida io en la nevera hasta por un mes.
3. Sección del cerebro en 50 micras rodajas finas sagittally usando vibratome. Recoger las secciones del cerebro usando un pincel suave. Terminar la actividad de peroxidasa endógena por incubación de las secciones en peróxido de hidrógeno 0,6% durante 30 min a temperatura ambiente.
4. Incubar las secciones de anticuerpo anti-calbindin diluida en el tampón de bloqueo (suero de cabra al 10% con azida de sodio 0,1% de Triton X-100 y 0,02% en PBS) durante la noche a temperatura ambiente. A continuación incubar las secciones en correspondiente anticuerpo secundario biotinilado diluido en tampón de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente.
5. Se incuban las secciones en DH avidina - tampón complejo H peroxidasa biotinilada para detectar la biotina durante 1 hora a temperatura ambiente. Desarrollar las secciones mediante el uso de sustrato de peroxidasa para visualizar el antígeno. Se lavan las secciones con PBS tres veces entre los pasos. Montar las secciones en portaobjetos de microscopio. Imagen de las secciones bajo el microscopio.

Resultados

La inyección de 20 mg / kg de poli (I: C) en E12.5 podría evocar una respuesta inflamatoria aguda en el eje-materno-fetal de la placenta y precipitar un efecto crónico para el desarrollo del cerebro y fenotipos conductuales ^12,13. Los niveles elevados de una citoquina proinflamatoria, interleuquina (IL) -6, es un indicador fiable de la respuesta inflamatoria aguda después de MIA. El tiempo máximo para la expresión del gen IL-6 en la placenta y el cerebro f...

Discusión

MIA inducción en diferentes ventanas de tiempo perturba diferentes eventos de desarrollo cerebral en roedores, y por lo tanto conduce a diferentes alteraciones del comportamiento y neuropatologías en la descendencia. Aquí, se describe un protocolo para inducir MIA en ratones con poli (I: C) de inyección en E12.5. Este método de inducción MIA conduce a comportamiento, neurológicos, inmunológicos y alteraciones gastrointestinales asociados con el autismo y la esquizofrenia en la descendencia ^8,10,11,16....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt	SIGMA	P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP	HOSPIRA	NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 mL 29G x 1/2"	COVIDIEN	8881600145
50 ml conical screw cap tubes	USA SCIENTIFIC	1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer	THERMO SCIENTIFIC	1000	Optional
Stereomicroscope	Wild Heerbrugg	M5A	Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06mm	Roboz	RS-5045	Optional
RNAlater RNA stabilization reagent	Qiagen	76104	Optional
TRIzol reagent	Life Technologies	15596-026	Optional
RQ1 Rnase-free DNase	Promega	M610A	Optional
iScript cDNA synthesis kit	Bio-Rad	170-8891	Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX	Roche	4913922001	Optional
Real-time PCR	ABI	7300	Optional
Primer: Il6 forward	Life Technologies	TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC	Optional
Primer: Il6 Reverse	Life Technologies	TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC	Optional
Primer: beta-actin forward	Life Technologies	AGAGGGAAATCGTGCGTGAC	Optional
Primer: beta-actin Reverse	Life Technologies	CAATAGTGATGACCTGGCCGT	Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate	Life Technologies	4306737	Optionl
MicroAmp optical adhesive film	Life Technologies	4311971	Optionl
EthoVision	Noldus	EthoVision	Optionl
SR-LAB apparatus (PPI)	San Diego Instruments	SR-LAB	Optionl
Marbles	PENN-PLAX	Blue gem stones marbles	Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21600-069	Optionl
Paraformaldehyde	MACRON	2621-59	Optionl
Vibratome	Leica	VT1000 S	Optionl
Sodium azide	Sigma	S2002	Optionl
Triton x-100	Sigma	X100	Optionl
Hydrogen peroxide solution	Sigma	18312	Optionl
Goat serum	Vector Laboratories	S-1000	Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody	Abcam	ab11426	Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody	Vector Laboratories	BA-1000	Optionl
VECTASTAIN ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000	Optionl