Indução de Maternal Immune Activation em Ratos na Fase Mid-gestação com Viral Mimic poli (I: C)

Resumo

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

Resumo

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Introdução

O conceito de ativação imune materna (MIA) tem origem nos estudos epidemiológicos sobre a associação da infecção materna com autismo e esquizofrenia ^1. Devido à ausência de agentes patogénicos virais detectáveis ​​se replicar na placenta ou do cérebro fetal após a infecção viral materna ^2,3, o efeito da infecção sobre a descendência é a hipótese de ser causadas pela activação do sistema imune materno, em vez do que os próprios agentes patogénicos .

Para elucidar a relação de causa e efeito entre MIA e distúrbios psiquiátricos, injecção de quimicamente sintetizados, viral mímico dupla polyinosinic ARN de cadeia: ácido polycytidylic (poli (I: C)) em roedores grávida tem sido amplamente utilizado como modelo animal para a MIA ^4,5. Poli (I: C) é reconhecida pelo receptor? Toll-like 3 (TLR3), e a administração sistémica de poli (I: C) induz-viral como a resposta inflamatória aguda. Um dos mecanismos pelos quais a poli (I: C) PRoduces anomalias comportamentais e neuropatologias na prole é por causando um desequilíbrio de citocinas pró-inflamatórias e anti no eixo materno-placentária-fetal ^6. Vários grupos adotaram o modelo MIA para compreender a etiologia dos transtornos psiquiátricos ^7, e devido aos diversos interesses entre grupos de pesquisa, vários pontos de tempo de ativação imune têm sido utilizados para alcançar diferentes perturbações no desenvolvimento do cérebro e comportamentos ^7.

O laboratório Paul H. Patterson no Califórnia Institute of Technology adota a estratégia de injecção de poli (I: C) em murganhos grávidas no dia embrionário 12,5 (E12.5), que demonstrou com sucesso que a MIA é capaz de induzir comportamental, neurológica, e alterações imunológicas na descendência que estão associados com a esquizofrenia e autismo ^8-11. Nossas obras anteriores mostram que MIA prole apresentar anomalias comportamentais (por exemplo, impairmen sociaist, défice de comunicação, comportamentos repetitivos, comportamento de ansiedade-like, e latente déficit de inibição ^8,10,12), imune desregulação e citocinas desequilíbrio ^8,13,14, alteração da expressão do gene do cérebro fetal ^15, perda de células de Purkinje no lóbulo VII do cerebelo ^11, alteração de propriedades sinápticas no hipocampo ^9, gene x interação ambiente ^13, alteração da permeabilidade do intestino e intestino composição da microbiota ^16. Além disso, as estratégias terapêuticas e profiláticas são também desenvolvido a partir deste sistema modelo ^13,16,17. Ao induzir MIA em E12.5, outros mostraram que MIA produz ativação fetal microglial e alteração de desenvolvimento colinérgicos no cérebro anterior basal ^18, cepa específica ^de interacção ^19, anormalidades ultra-estruturais do cérebro sinaptossomais cerebral, mitocondriais respiratórias anormalidades cadeia hiperfunção, o downregulation das moléculas sinaptossomais cerebrais ¹⁷ ,comportamentos de tipo depressivo, déficit cognitivo e do hipocampo potenciação de longa duração (LTP) e déficit de neurogênese adulta ^20.

Aqui, nós fornecemos um método detalhado de como induzir MIA em E12.5 por poli (I: C), bem como os paradigmas de como aplicar este modelo para estudar a etiologia da esquizofrenia e autismo. É importante notar que a MIA é um factor de risco para uma variedade de distúrbios ^4, e os seus resultados são extremamente sensíveis ao tempo e método de indução, bem como a criação de barragens grávidas. Como tal, mesmo pequenas inconsistências entre laboratórios muitas vezes resultam em baixa reprodutibilidade e / ou diferentes fenótipos na descendência. Nosso método é projetado especificamente para os interessados ​​em estudar MIA como um fator de risco ambiental para o autismo e esquizofrenia, e a descrição detalhada fornecida irá ajudar os pesquisadores a melhorar a reprodutibilidade dos seus dados.

Protocolo

Todos os protocolos foram realizados sob a aprovação do California Institute of Comité Cuidados e Uso de Animais Institucional Tecnologia (IACUC).

1. Preparação para Pairs cronometrado-acasalamento

1. Use pelo menos 6 barragens para experimentos comportamentais e 3 para análise da expressão gênica.
   NOTA: Use o dobro do número de ratos fêmeas estimados, já que apenas cerca de 50% dos ratos será conectado a partir da cronometrado-acasalamento.
2. Use ratos fêmea com nenhum gravidez antes e, 8-16 semanas de idade.
   NOTA: os ratos fêmeas que tenham exposição sexual antes de camundongos machos, mas não foram grávida são aceitáveis.
3. Casa a ratos fêmea juntos e colocar as gaiolas ao lado do outro, a fim de sincronizar o ciclo estral. Use uma gaiola de ratos padrão com uma altura de mais de 5,5 polegadas e um piso interior 75 polegada quadrada para permitir habitação de 5 ratos adultos. Etiquetar cada rato fêmea utilizando um soco orelha.

2. Configurando cronometrado-mating Pair

1. Configure o cronometrado-acasalamento 0-2 horas antes do ciclo escuro começa. Coloque dois ratos fêmeas em cada gaiola. Retire os ratos e pesá-los individualmente. Registe o peso do corpo de cada ratinho fêmea.
2. Coloque um rato macho em cada gaiola com as duas fêmeas de camundongo. Use trio de acoplamento para minimizar o efeito paterno confundindo.

3. Vaginal bujão de verificação (E0.5)

1. Verifique a fêmea ratos 0-4 horas após o ciclo escuro termina. Levante cuidadosamente o rato fêmea da base da cauda e permitir que o mouse para pegar a grade de arame, gaiola superior, ou a borda gaiola.
2. Procurar sinais de plugue vaginal: plugue vaginal é uma massa esbranquiçada visível na abertura vaginal. Se a ficha não é óbvio, insira suavemente uma ponteira 200 mL na abertura vaginal. Resistência de coagulação confirma formação de um tampão vaginal. Verifique o plugue vaginal uma vez por dia.
   NOTA: plugue Vaginal é apenas uma indicação de que a cópula ocorreu e, portanto, não ggravidez ARANTIA. rolhão vaginal podem ser difíceis de identificar, em determinadas estirpes de murganhos. Procure a ajuda de um cuidador ratos experiente para aumentar a precisão da identificação plugue.
3. Mova os ratos ligados a uma nova gaiola e grupo abrigá-los. Definir o dia da aparição plugue vaginal como embrionária 0,5 dia (E0.5).

4. Na E10.5-11.5, verificar se a gravidez

1. Levante cuidadosamente a base da cauda e permitir que o mouse para pegar a grade de arame, gaiola superior, ou a borda gaiola. Observe a área do abdômen para verificar se há sinais de gravidez, por exemplo, uma protuberância no abdômen (Figura 1).
   NOTA: O sinal de gravidez é sempre mais óbvio à E11.5 do que em E10.5.
2. Pesar os ratinhos para verificar a gravidez. O ratinho grávida geralmente pesa cerca de 20% mais pesados ​​em E10.5 e 30% mais pesados ​​em E12.5 em comparação com um ratinho não grávidas (Figura 2). Única casa os ratos grávidas em gaiolas limpas.

5. 20 mg /kg de poli (I: C) Preparação

1. Use pelo menos 6 barragens por grupo para experimentos comportamentais e 3 por grupo para análise de expressão de genes. Prepara-se o valor correspondente de poli (I: C).
2. Pesa-se o poli (I: C) de pó num tubo de 50 ml para fazer uma concentração final de 40 mg / ml. A fim de minimizar e padronizar o stress causado pelo volume de injecção, injectar 5 ul de poli (I: C) por cada grama de peso corporal do rato (5 mL / g, ou 5 ml / kg). Para induzir a MIA, que injectar 20 mg de poli (I: C) por kg.
   NOTA: A concentração de poli (I: C) é necessária (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Uma vez que a poli (I: C) em pó contém 10% de poli (I: C), é necessário fazer uma concentração final de ml de poli (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / (I: C).
   CUIDADO: O poli (I: C) em pó é muito leve. Tenha cuidado para não perder qualquer pó durante a transferência da espátula para o tubo cônico.
3. Adicionar o volume correspondente de cloreto de sódio a 0,9% (solução salina) para a banheira cónicae e fechar a tampa. Dissolve-se o pó por laminagem suavemente a gota de solução salina através da poli (I: C) de pó até a solução ficar clara. Centrifuga-se o tubo cónico a 800 xg durante 1 min (Figura 3C). Filtra-se o poli: solução por filtro de 0,22? M (I C). Transferir o poli: solução (I C) para um tubo de 1,5 ou 2 ml de microcentrífuga. Opcional: Use um espectrofotómetro para medir a razão entre o poli (I: C) 260/280 solução. Assegurar o rácio situa-se entre 1,54-1,82 (Figura 3) tal como descrito pelo fabricante. NOTA: A solução salina utilizada para dissolver o poli (I: C) em pó e servem como controlo de injecção deve ser de grau farmacêutico e estéril.

6. Saline ou poli (I: C) Injeção em E12.5

1. Pesar o rato na escala e colocá-lo de volta para a jaula. Utilize a seguinte fórmula para calcular o volume de injecção tanto para solução salina e poli (I: C) ratos: o peso corporal (g) multiplicados por 5 = volume de injecção desejado (ul). Use um insul 0,3 mlem seringa para elaborar o volume calculado de solução salina ou 20 mg / kg de poli (I: C), por exemplo, 150 mL de um rato 30 g.
2. Gentilmente pegar o mouse pela base da cauda e colocá-lo no topo da gaiola. Lidar com o mouse com cuidado para evitar efeitos de confusão induzida por stress. Inserir a agulha, bisel para cima, a aproximadamente 20 ° em relação ao rato para o centro dos seus dois bocais superiores (Figura 4), ​​e injectar o (I: C) solução salina ou solução de poli. NOTA: A agulha deve ser substituída para cada rato após a injeção.
3. Posicione o mouse de volta para sua gaiola. Coloque as gaiolas numa zona calma, de baixo sala de tráfego para evitar outros efeitos de confusão.

7. O Dia Depois de poli (I: C) Injeção (E13.5)

1. Verificar os ratinhos injectados na manhã seguinte. Use uma escala para medir o peso corporal.
   NOTA: poli (I: C) injectados murganhos grávidas geralmente ganhar menos peso do que os murganhos injectados solução salina no dia após a injexão.
2. Não perturbe os ratos até que a prole nascem.

8. Medidor de MIA Offspring

1. A fim de minimizar os efeitos de indução de MIA, siga as diretrizes listadas abaixo para medir o uso de MIA prole.
   1. Excluir as ninhadas de prematuro ou nascimento atrasado, ou se o tamanho da leitegada é menor do que 5.
   2. Euthanize os filhotes excessivas de CO _2, se o tamanho da ninhada é maior do que 10.

9. Opcional: Examine a resposta inflamatória aguda Após MIA

1. Sacrificar a grávida ratos 3 horas após soro fisiológico ou poli (I: C) injecção utilizando o método descrito no protocolo aprovado-comité cuidados com os animais da instituição.
   NOTA: Deslocação cervical é muitas vezes preferido, uma vez que minimiza o efeito de CO drogas ₂ / eutanásia sobre a barragem e do embrião.
2. Recolher o baço dos camundongos grávidas adultos e isolar a placenta e bra fetalno sob o microscópio estereoscópico.
   1. Para a coleta de baço, coloque o mouse sobre a placa de dissecação e pulverizar 70% de etanol na região abdominal dos ratos grávidas. Utilizar um par de tesouras estéreis para fazer um corte vertical, no centro da área abdominal abaixo da caixa torácica através da pele.
   2. O baço fica no quadrante abdominal superior, esquerda. Use uma pinça para isolar o baço. Rolar o baço em limpadores tarefa delicada para remover o tecido adiposo em torno do órgão. Recolher cerca de 50 mg de tecido do baço e colocá-los individualmente em tubos de Eppendorf com 500 RNA ul estabilizar tampão ou TRIzol para evitar a degradação do ácido nucleico. Armazenar as amostras a -80 ° C até à sua utilização congelador.
   3. Para a coleta de placenta, retire com cuidado os cornos uterinos do corpo. Coloque as trompas uterinas num prato de Petri cheio com solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS) e deixar o prato em gelo. Use duas pinças para rasgar a parede uterina e expor o saco amniótico.
      1. Cuidadosamente usar a pinça para abrir o saco amniótico, sem danificar a placenta e o feto. Separa-se a placenta do feto e cortar o cordão umbilical tão perto quanto possível da placenta. Remover o saco amniótico detritos a partir da placenta. Coloque a placenta individualmente em tubos de Eppendorf com 500 ul de ARN estabilizar tampão ou Trizol. Armazenar a amostra a -80 ° C até à sua utilização congelador.
   4. Para a coleta de cérebro fetal, armazenar o feto no RNA estabilizar tampão do passo 9.2.2 até dissecção. Amole fora da membrana pial do ventrículo do cérebro utilizando fórceps delicados # 5 sob o microscópio estereoscópico. Remova cuidadosamente toda a membrana do cérebro fetal. Coloque os cérebros fetais individualmente em tubos de Eppendorf com 500 RNA ul estabilizar tampão ou TRIzol. Armazenar a amostra a -80 ° C até à sua utilização congelador.
3. Extrai-se a ARN a partir do tecido e converter o ARN em ADNc. Analisar a expressão de genes IL6 no cDNA por real-time PCR.
4. Extrai-se a ARN dos tecidos, seguindo o protocolo de fabrico de TRIzol. Se os tecidos são armazenados no buffer de estabilização de ARN. Descongelar a amostra e girar o buffer. Transferir o tecido por ponta para outro eppendorf com 500 mL de TRIzol e continuar a extracção de ARN.
5. Utilizar um espectrofotómetro para determinar a concentração de, 260/280 e 260/230 razão do ARN. Certifique-se os índices são acima de 2,0.
6. Eliminar a contaminação de ADN do ARN por tratamento com ADNase I. mistura de 1 ug de ARN, 1 ul de tampão de reacção 10X, 1 ul de DNase isenta de RNase, e água isenta de nuclease para um volume final de 10 ul. Incubar a mistura principal a 37 ° C durante 30 min. Adicione 1 solução DNase parada ul para terminar a reacção. Incubar a mistura a 65 ° C durante 10 min.
7. Reverter transcrever o RNA para cDNA. Usar 20 reacções ul, e até 1 ug de ARN total por reacção. Misture 4 l de 5x tampão de transcrição reversa (RT) mistura de reacção, 1 ul reverse transcriptase, 11 ul de molde de ARN após tratamento com ADNase I e 4 ul livre de nuclease _H2O para fazer uma solução final de 20 ul. Programar as condições termociclador para RT. Uma condição genérica incluem: Passo 1: 25 ° C durante 5 min; Passo 2: 42 ° C durante 30 min; Passo 3: 85 ° C durante 5 min; Passo 4: manter a 4 ° C. Dilui-se o ADNc de 5 vezes. Para armazenagem a curto prazo, armazenar o ADNc a 4 ° C. Para armazenamento a longo prazo, congelar o cDNA a -20 ° C.
8. Analisar a expressão do gene IL6 no cDNA por PCR em tempo real e normalizar a expressão do gene IL-6 para a p-actina a expressão do gene.
   1. Faça uma mistura mestre para IL6 e detecção de β-actina. Usar 25 ul de reacção, a mistura principal para cada gene inclui 12,5 uL da mistura de SYBR Verde, 0,5 ul de 10 mM iniciador directo, 0,5 ul de 10 pM e iniciador inverso 6,5 ul livre de nuclease H ₂ O.
   2. Coloque 5 jul 5x diluída cDNA umt o fundo do poço da placa de reacção óptica de 96 poços. Pipetar 20 ul de mistura principal para cada poço, para fazer uma de 25 uL finais mistura de PCR. Triplicado, cada gene para cada amostra. Selar a placa usando película adesiva óptica. Girar a placa a 800 xg durante 3 min a 4 ° C, utilizar o programa standard de PCR em tempo real: Passo 1: 50 ° C durante 2 min; Passo 2: 95 ° C durante 10 min; Passo 3: 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e a temperatura de 60 ° C durante 1 min. Adicionar uma etapa adicional para a curva de dissociação.

10. Examine as anormalidades comportamentais em Offspring MIA Adulto (opcional):

1. Execute os testes de comportamento nas idades de 8-12 semanas. Mudar a cama gaiola de pelo menos 3 dias antes do teste. Aclimatar os ratos ao ambiente de teste comportamental, pelo menos, 30 min antes do teste.
2. Para a inibição pré-pulso (PPI), restringir os ratos no cilindro de plexiglass com um sensor piezo-elétrico debaixo dela. Aclimatar os ratos ao PPIcâmara por 5 min. Expor os ratos com 6 ensaios de 120 dB de ruído branco (sobressalto).
3. Em seguida, expor os ratos com misturas randomizados de 14 ensaios de ruído de fundo, 14 ensaios de sobressalto, 14 ensaios de pré-pulso 5 dB (5 dB maior do que o ruído de fundo) + Startle (PPI5), e 14 ensaios de pré-pulso de 15 dB (15 dB mais elevados do que o ruído de fundo + Startle (PPI15).
4. Em média, a resposta de sobressalto para os primeiros 6 ensaios de 120 ensaios dB. Em média, a resposta de sobressalto para os outros estímulos individuais. Converter o valor para a inibição pré-pulso por (Startle - PPI5 ou PPI15) / Startle.
5. Para o teste de campo aberto, coloque o mouse no canto de uma arena praça aberta (50 x 50 x 50 cm ^3). Grave a trajetória do rato durante 10 min através de uma câmera montada no teto. Definir o centro de como a zona central (17 x 17 ^cm2) na arena. Quantificar a distância percorrida, entradas de fuso centro, eo tempo passado na zona centro manualmente ou por software de análise automática baseada em imagem.
6. Para o teste de enterramento mármore, aclimatar o mouse para uma gaiola de teste com cinco centímetros de profundidade comprimido, roupas de cama de pinho, limpo Aspen para 10 min. Devolver o mouse para a sua homecage. Delicadamente, coloque 20 azul marinho 1,5 cm de diâmetro bolinhas de vidro na forma de 4 x 5 arranjo. Coloque o mouse de volta para a jaula de teste com berlindes para 10 min. Conte os mármores que tem sido enterrados no período de testes de 10 min.

11. Examine a neuropatologia cerebelar em Offspring MIA Adulto (opcional):

1. Eutanásia do salina e MIA filhos adultos pelo anestésico. Perfundir o rato com 50 ml de PBS e, subsequentemente, 50 ml de 4% de paraformaldeído através do sistema cardiovascular.
2. Remover cuidadosamente o cérebro e pós- fixarem o cérebro em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C. Lavar o cérebro com PBS três vezes, e armazenar o cérebro em PBS com 0,02% de azida de sódio num frigorífico a 4 ° C até à sua utilização.
   NOTA: O cérebro fixadas posteriormente pode ser armazenado em PBS com 0,02% de SODazida ium na geladeira por até um mês.
3. Seção do cérebro em 50 mm fatias finas sagital utilizando vibratome. Recolher as seções do cérebro usando um pincel macio. Terminar a actividade da peroxidase endógena por incubação das secções em peróxido de hidrogénio a 0,6% durante 30 min à temperatura ambiente.
4. Incubam-se as secções em anticorpo anti-calbindina diluído no tampão de bloqueio (soro de cabra a 10% com 0,1% de Triton X-100 e 0,02% de azida de sódio em PBS) durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, incubar as secções na correspondente anticorpo secundário biotinilado diluído em tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente.
5. Incubam-se as secções em DH avidina - peroxidase de tampão H complexo biotinilado para detectar a biotina, durante 1 h à temperatura ambiente. Desenvolver as secções utilizando o substrato de peroxidase para visualizar o antigénio. Lavam-se as secções com PBS três vezes entre os passos. Montar as secções em lâminas de microscópio. Imagem as seções sob o microscópio.

Resultados

A injecção de 20 mg / kg de poli (I: C) em E12.5 pode evocar uma resposta inflamatória aguda no eixo materno-fetal e placentário-precipitar um efeito crónico para o desenvolvimento do cérebro e fenótipos comportamentais ^12,13. Os níveis elevados de uma citocina pró-inflamatória, interleucina (IL) -6, é um indicador fiável da resposta inflamatória aguda após MIA. O tempo de pico para a expressão do gene IL6 na placenta e no cérebro fetal é de 3 h...

Discussão

indução MIA em diferentes janelas de tempo perturba diferentes eventos de desenvolvimento cerebral em roedores e, consequentemente, leva a anomalias comportamentais diferentes e neuropatologias na prole. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir MIA em camundongos com poli (I: C) injecção a E12.5. Este método de indução MIA leva a comportamental, neurológica, imunológico, e anomalias gastrointestinais associados com o autismo e esquizofrenia na prole ^8,10,11,16. É importante notar que, porque MIA ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt	SIGMA	P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP	HOSPIRA	NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 mL 29G x 1/2"	COVIDIEN	8881600145
50 ml conical screw cap tubes	USA SCIENTIFIC	1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer	THERMO SCIENTIFIC	1000	Optional
Stereomicroscope	Wild Heerbrugg	M5A	Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06mm	Roboz	RS-5045	Optional
RNAlater RNA stabilization reagent	Qiagen	76104	Optional
TRIzol reagent	Life Technologies	15596-026	Optional
RQ1 Rnase-free DNase	Promega	M610A	Optional
iScript cDNA synthesis kit	Bio-Rad	170-8891	Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX	Roche	4913922001	Optional
Real-time PCR	ABI	7300	Optional
Primer: Il6 forward	Life Technologies	TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC	Optional
Primer: Il6 Reverse	Life Technologies	TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC	Optional
Primer: beta-actin forward	Life Technologies	AGAGGGAAATCGTGCGTGAC	Optional
Primer: beta-actin Reverse	Life Technologies	CAATAGTGATGACCTGGCCGT	Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate	Life Technologies	4306737	Optionl
MicroAmp optical adhesive film	Life Technologies	4311971	Optionl
EthoVision	Noldus	EthoVision	Optionl
SR-LAB apparatus (PPI)	San Diego Instruments	SR-LAB	Optionl
Marbles	PENN-PLAX	Blue gem stones marbles	Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21600-069	Optionl
Paraformaldehyde	MACRON	2621-59	Optionl
Vibratome	Leica	VT1000 S	Optionl
Sodium azide	Sigma	S2002	Optionl
Triton x-100	Sigma	X100	Optionl
Hydrogen peroxide solution	Sigma	18312	Optionl
Goat serum	Vector Laboratories	S-1000	Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody	Abcam	ab11426	Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody	Vector Laboratories	BA-1000	Optionl
VECTASTAIN ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000	Optionl