Die Induktion der mütterliche Immunaktivierung bei Mäusen in der Mitte der Schwangerschaft Bühne mit Viral Mimic Poly (I: C)

Zusammenfassung

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

Zusammenfassung

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Einleitung

Das Konzept der mütterlichen Immunaktivierung (MIA) stammt aus den epidemiologischen Studien über die Assoziation der Infektion der Mutter mit Autismus und Schizophrenie ^1. Aufgrund des Fehlens von nachweisbarem replizierenden viralen Pathogenen in der Plazenta oder fetalen Gehirn nach mütterlichen Virusinfektion ^2,3, wird die Wirkung der Infektion auf die Nachkommen Hypothese eher durch die Aktivierung des mütterlichen Immunsystem verursacht werden , als die Pathogene selbst .

Polycytidylsäure: Um die Ursache-Wirkungs-Beziehung zwischen MIA und psychiatrischen Störungen, die Injektion von chemisch synthetisierten, viral mimic doppelsträngige RNA polyinosinic aufzuklären (poly (I: C)) in schwangeren Nagetieren wurde als Tiermodell für MIA weit verbreitet ^4,5. Poly (I: C) von Toll-like-Rezeptor erkannt wird 3 (TLR3) und die systemische Verabreichung von Poly (I: C) induziert viral wie akute Entzündungsreaktion. Einer der Mechanismen, durch die poly (I: C) produces Verhaltensstörungen und Neuropathologien bei den Nachkommen wird durch ein Ungleichgewicht von pro- und anti - inflammatorischen Zytokinen in der mütterlichen Plazenta-fetalen Achse ⁶ verursacht. Mehrere Gruppen haben die MIA - Modell angenommen , die Ätiologie von psychiatrischen Störungen ⁷ und aufgrund der unterschiedlichen Interessen zwischen Forschungsgruppen, verschiedenen Zeitpunkten der Immunaktivierung verwendet worden , um zu verstehen , ⁷ verschiedene Störungen auf die Entwicklung des Gehirns und das Verhalten zu erreichen.

Das Paul H. Patterson Labor am California Institute of Technology nimmt die Strategie der Injektion von Poly (I: C) in trächtigen Mäusen an embryonalen 12,5 Tage (E12,5), die erfolgreich unter Beweis gestellt hat, dass MIA induzieren Verhaltens-, neurologische fähig ist, und immunologische Veränderungen bei den Nachkommen , die mit Autismus und Schizophrenie ^8-11 verbunden sind. Unser Stand der Arbeiten zeigen , dass MIA Nachwuchs Verhaltensauffälligkeiten zeigen (zB soziale impairment, Kommunikationsdefizit, repetitive Verhalten, Angst-ähnliches Verhalten und latente Hemmung Defizit ^8,10,12), Immundysregulation und Zytokine Ungleichgewicht ^8,13,14, Veränderung des fötalen Gehirns Genexpression ^15, Verlust der Purkinje - Zellen in Läppchen VII von Cerebellum ^11, Veränderung der synaptischen Eigenschaften in Hippocampus ^9, Gen - Umwelt - Interaktion x ^13, Veränderung der Darmdurchlässigkeit und Darmmikrobiota Zusammensetzung ^16. Darüber hinaus werden therapeutische und prophylaktische Strategien auch von diesem Modellsystem ^13,16,17 entwickelt. Durch die Induktion MIA bei E12,5, andere haben gezeigt , dass MIA fötalen Mikrogliaaktivierung und cholinergen Entwicklungs Veränderung in basalen Vorderhirns ^18, Stamm spezifische Wechselwirkung ^19, Gehirn zerebralen synaptosomaler ultra Anomalien, zerebrale mitochondrialen Atmungskette Überfunktion abnormalties, Herabregulation der zerebralen synaptischen Moleküle ¹⁷ erzeugt .depressiv-ähnliche Verhaltensweisen, Beeinträchtigung der Kognition und des Hippocampus Langzeit - Potenzierung (LTP), und das Defizit von Erwachsenen Neurogenese im Hippocampus ^20.

Hier bieten wir eine detaillierte Methode, wie MIA zu induzieren bei E12,5 von Poly (I: C), sowie Paradigmen, wie dieses Modell anzuwenden, um die Entstehung von Autismus und Schizophrenie zu studieren. Es ist wichtig zu beachten , dass MIA ein Risikofaktor für eine Vielzahl von Erkrankungen ist ^4, und dessen Ergebnisse sind extrem empfindlich gegenüber der Zeit und Methode der Induktion sowie die Haltung der trächtigen Muttertieren. Als solche auch kleinere Unstimmigkeiten zwischen den Laboratorien führen oft zu geringe Reproduzierbarkeit und / oder unterschiedlichen Phänotypen bei den Nachkommen. Unsere Methode ist für die Interessenten an einem Studium MIA als Umweltrisikofaktor für Autismus und Schizophrenie speziell entwickelt, und die detaillierte Beschreibung wird es den Forschern zur Verfügung gestellt helfen, die Reproduzierbarkeit ihrer Daten zu verbessern.

Protokoll

Alle Protokolle wurden im Rahmen der Genehmigung des California Institute of Technology Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Vorbereitung für Timed-Paarung Paare

1. Verwenden Sie mindestens sechs Dämme für Verhaltensexperimente und 3 für die Genexpressionsanalyse.
   HINWEIS: die doppelte Anzahl der geschätzten weiblichen Mäusen, da nur etwa 50% der Mäuse aus der timed-mating eingesteckt werden.
2. Verwenden weibliche Mäuse ohne vorherige Schwangerschaft und bei 8-16 Wochen alt sind.
   HINWEIS: Weibliche Mäuse, die vor sexuellen Kontakt mit männlichen Mäusen haben, aber noch nicht schwanger gewesen sind akzeptabel.
3. Haus der weiblichen Mäusen zusammen und legen Sie die Käfige nebeneinander, um ihre Östrocyclus zu synchronisieren. Verwenden Sie ein Standard-Mäuse Käfig mit einer Höhe von mehr als 5,5 Zoll und einer 75 Quadratzoll Innenboden Gehäuse von 5 erwachsenen Mäusen zu ermöglichen. Beschriften Sie jede weibliche Maus mit einem Ohr Schlag.

2. Einrichten Timed-mating Pair

1. Stellen Sie die timed-Paarung 0-2 Stunden, bevor der Dunkel-Zyklus beginnt. Legen Sie zwei weibliche Mäuse in jedem Käfig. Nehmen Sie die Mäuse heraus und wiegen sie einzeln. Nehmen Sie das Körpergewicht der einzelnen weiblichen Maus.
2. Legen Sie eine männliche Maus in jedem Käfig mit den beiden weiblichen Mäusen. Verwenden trio Paarungs das väterliche Verwechselung Effekt zu minimieren.

3. Vaginalpfropfens Check (E0.5)

1. Überprüfen Sie die weibliche Mäuse 0-4 Stunden nach der Dunkel-Zyklus endet. Heben Sie vorsichtig die weibliche Maus aus der Basis des Schwanzes und lassen Sie die Maus, um das Drahtgitter, Käfig oben oder Käfigrand zu greifen.
2. Suchen Sie nach Anzeichen von Vaginalpfropfens: Vaginalpfropfens ist eine sichtbare weißliche Masse in die vaginale Öffnung. Wenn der Stecker nicht offensichtlich ist, legen Sie vorsichtig mit einem 200 ul Pipettenspitze in die vaginale Öffnung. Widerstand von Koagulation bestätigt Vaginalpfropfens Bildung. Überprüfen Sie die Vaginalpfropfens einmal pro Tag.
   HINWEIS: Vaginal Stecker ist nur ein Hinweis darauf, dass der Kopulation, aufgetreten ist und daher nicht funktioniert guarantee Schwangerschaft. Vaginalpfropfens kann schwierig sein, in bestimmten Stämmen von Mäusen zu identifizieren. Wenden Sie sich an einen erfahrenen Mäuse Betreuer, die Genauigkeit der Stecker Identifizierung zu erhöhen.
3. Bewegen Sie die gesteckten Mäuse in einen neuen Käfig und Gruppe beherbergen sie. Definieren Sie den Tag der Vaginalpfropfens Aussehen wie embryonale 0,5 Tage (E0.5).

4. Auf E10.5-11.5, Check für Schwangerschaft

1. Heben Sie vorsichtig die Basis des Schwanzes und lassen Sie die Maus, um das Drahtgitter, Käfig oben oder Käfigrand zu greifen. Beachten Sie die Bauchbereich auf Anzeichen einer Schwangerschaft zu überprüfen, zum Beispiel eine Ausbuchtung im Bauch (Abbildung 1).
   HINWEIS: Das Zeichen der Schwangerschaft ist immer deutlicher bei E11,5 als bei E10,5.
2. Wiegen Sie die Mäuse Schwangerschaft zu überprüfen. Die schwangere Maus wiegt im Allgemeinen ungefähr 20% schwerer bei E10.5 und 30% schwerer bei E12.5 im Vergleich zu einer nicht-schwangeren Maus (Abbildung 2). Einfamilienhaus die schwangere Mäuse in saubere Käfige.

5. 20 mg /kg Poly (I: C) Herstellung

1. Verwenden Sie mindestens sechs Dämme pro Gruppe für Verhaltensexperimente und 3 pro Gruppe für die Genexpressionsanalyse. Bereiten Sie die entsprechende Menge an Poly (I: C) Lösung.
2. Wiegen Sie die poly (I: C) -Pulver in einem 50 ml konischen Röhrchen eine Endkonzentration von 40 mg / ml herzustellen. Um die Spannung, die durch Injektionsvolumen zu minimieren und zu standardisieren, injizieren 5 ul poly (I: C) Lösung pro Gramm Körpergewicht der Maus (5 & mgr; l / g bzw. 5 ml / kg). Zu induzieren MIA injizieren wir 20 mg Poly (I: C) pro kg.
   HINWEIS: Die Konzentration von Poly (I: C) Lösung erforderlich ist (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Da das poly (I: C) Pulver enthält 10% poly (I: C), benötigen wir eine Endkonzentration von (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml Poly (I: C), um Lösung.
   ACHTUNG: Die Poly (I: C) Pulver ist sehr leicht. Achten Sie darauf, keine Pulver zu verlieren, während aus dem Spachtel auf den konischen Röhrchen übertragen.
3. Fügen Sie die entsprechenden Volumen von 0,9% Natriumchlorid (Kochsalzlösung) in den konischen Wannee und die Kappe schließen. Lösen Sie das Pulver durch sanft die Salztropfen über der Poly-Walzen (I: C) Pulver, bis die Lösung klar ist. Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen bei 800 g für 1 min (3C). Filtern die poly (I: C) Lösung von 0,22-um-Filter. Übertragen die poly (I: C) Lösung eines 1,5 oder 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Optional: ein Spektralphotometer Verwenden Sie das 260/280 Verhältnis des Poly (I: C) zu messen Lösung. Sicherstellen , dass das Verhältnis zwischen 1,54 bis 1,82 (3) , wie vom Hersteller beschrieben. HINWEIS: Die Kochsalzlösung verwendet Poly aufzulösen (I: C) Pulver und dienen als Kontroll Injektion sollte steril und pharmazeutischer Qualität sein.

6. Saline oder Poly (I: C) Injection auf E12.5

1. Wiegen Sie die Maus auf die Waage und steckte es wieder in den Käfig. Verwenden Sie die folgende Formel, um das Volumen der Injektion sowohl für Kochsalzlösung und Poly zu berechnen (I: C) Mäuse: Körpergewicht (g), multipliziert mit 5 = gewünschte Injektionsvolumen (ul). Verwenden Sie ein 0,3 ml insul(I: C) Lösung, beispielsweise 150 & mgr; l für eine 30 g Maus in der Spritze das berechnete Volumen Kochsalzlösung oder 20 mg / kg Poly auszuarbeiten.
2. holen Sie vorsichtig die Maus durch die Basis des Schwanzes und legen Sie es auf der Oberseite des Käfigs. Behandeln Sie die Maus verwirrende Effekte sanft durch Stress ausgelöst zu vermeiden. Führen Sie die Nadel, Fase auf, bei etwa 20 ° gegenüber der Maus in die Mitte seiner beiden oberen Nippel (Abbildung 4), und injizieren , um die Kochsalzlösung oder Poly (I: C) Lösung. HINWEIS: Die Nadel sollte für jede Maus nach der Injektion ersetzt werden.
3. Platzieren Sie die Maus wieder in seinen Käfig. Legen Sie die Käfige in einer ruhigen, wenig Verkehr Zimmer, die anderen verwirrende Effekte zu vermeiden.

7. Der Tag nach Poly (I: C) Injektion (E13.5)

1. Schauen Sie sich die injizierten Mäuse am folgenden Morgen. Verwenden Sie eine Skala Körpergewicht zu messen.
   HINWEIS: Poly (I: C) injiziert trächtige Mäuse gewinnen in der Regel weniger Gewicht als Salz Mäuse am Tag nach inj injiziertection.
2. Bitte nicht stören die Mäuse, bis die Nachkommen geboren werden.

8. Spur von MIA Nachkommen

1. Um die verwirrende Wirkung von MIA Induktion zu minimieren, befolgen Sie die unten aufgeführten Richtlinien die Verwendung von MIA Nachkommen zu messen.
   1. Schließen Sie die Würfe von Frühgeborenen oder verzögerte Geburt, oder wenn die Wurfgröße kleiner als 5.
   2. Euthanize die übermäßigen Welpen von CO ₂ , wenn die Wurfgröße größer als 10 ist.

9. Optional: Überprüfen Sie die akute Entzündungsantwort nach MIA

1. Opfere die schwangere Mäuse 3 Stunden nach der Kochsalzlösung oder Poly (I: C) Injektion mit dem beschriebenen Verfahren in der Tierpflege Institution Ausschuss genehmigten Protokoll.
   HINWEIS: Cervical Dislokation wird oft bevorzugt , da sie die Wirkung von CO ₂ / Euthanasie Medikamente auf dem Damm und embryo minimiert.
2. Sammeln Sie die Milz von den erwachsenen schwangeren Mäusen und zu isolieren, die Plazenta und fetale brain unter dem Stereomikroskop.
   1. Für Milz Sammlung, legen Sie die Maus auf die Dissektion Platte und 70% Ethanol auf den Bauchbereich der schwangeren Mäusen sprühen. ein Paar sterile Schere unter dem Brustkorb durch die Haut einen vertikalen Schnitt in der Mitte der Bauchbereich zu machen.
   2. Die Milz liegt in der linken überlegen Bauch. Verwenden einer Pinzette, die Milz zu isolieren. Rollen Sie die Milz auf heikle Aufgabe Wischer, um das Fettgewebe um das Organ zu entfernen. Sammeln Sie in etwa 50 mg Milzgewebe und legen Sie sie einzeln in Eppendorf-Röhrchen mit 500 & mgr; l RNA stabilisieren Puffer oder TRIzol zu Nukleinsäure-Abbau zu verhindern. Lagern Sie die Proben bei -80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.
   3. Für Plazenta Sammlung, ziehen Sie vorsichtig die Gebärmutterhörner aus dem Körper. Legen Sie die Gebärmutterhörner in einer Petrischale gefüllt mit autoklavierten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und lassen Sie die Schüssel auf dem Eis. Verwenden Sie zwei Zangen die Gebärmutterwand aufreißen und die Fruchtblase aus.
      1. Verwenden Sie vorsichtig die Pinzette die Fruchtblase zu öffnen, ohne die Plazenta und den Fötus schädigen. Trennen Sie die Plazenta von der Fötus und schneiden die Nabelschnur so nah an der Plazenta wie möglich. Entfernen Sie die Fruchtblase Trümmer aus der Plazenta. Legen Sie die Plazenta einzeln in Eppendorf-Röhrchen mit 500 & mgr; l RNA-Puffer oder TRIzol stabilisieren. Lagern Sie die Probe bei -80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.
   4. Für fötale Gehirn Sammlung, Speicherung der Fötus in der RNA-Puffer von Schritt 9.2.2 bis Dissektion stabilisieren. Necken die pialen Membran aus dem Ventrikel des Gehirns mit zarten # 5 Pinzette unter dem Stereomikroskop ab. Entfernen Sie vorsichtig alle die Membran von der fetalen Gehirns. Legen Sie die fötale Gehirn einzeln in Eppendorf-Röhrchen mit 500 & mgr; l RNA-Puffer oder TRIzol stabilisieren. Lagern Sie die Probe bei -80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.
3. Extrahieren Sie die RNA aus dem Gewebe und wandeln die RNA in cDNA. Analysieren Sie den IL - 6 - Gen - Expression in der cDNA durch real-time PCR.
4. Extrahieren Sie die RNA aus den Geweben durch Befolgen der Herstellung Protokoll TRIzol. Wenn die Gewebe in RNA Stabilisierungspuffer gespeichert. Tauen Sie die Probe und drehen Sie den Puffer nach unten. Übertragen Sie das Gewebe durch die Spitze auf einen anderen eppendorf mit 500 ul TRIzol und RNA-Extraktion fortzusetzen.
5. Verwenden Sie ein Spektralfotometer, die Konzentration, 260/280 und 260/230 Verhältnis der RNA zu messen. Sicherstellen, dass die Verhältnisse über 2,0 sind.
6. Beseitigen die DNA Kontamination durch behandelt, um die RNA mit DNase I. Mix 1 & mgr; g RNA, 1 & mgr; l 10X-Reaktionspuffer, 1 & mgr; l RNase-Free DNase und Nuklease-freies Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 & mgr; l. Inkubieren des Mastermix bei 37 ° C für 30 min. 1 & mgr; l DNase Stop-Lösung, um die Reaktion zu beenden. Inkubieren der Mischung bei 65 ° C für 10 min.
7. Kehrt die RNA in cDNA transkribiert. Verwenden 20 ul-Reaktionen und bis zu 1 & mgr; g Gesamt-RNA pro Reaktion. Mix 4 ul 5x Transkription (RT) Reaktionsmischung Puffer umkehren, 1 & mgr; l reverse Transkriptase, 11 & mgr; l RNA - Matrize nach der Behandlung mit DNase I und 4 & mgr; l Nuklease-freies H ₂ O , um eine endgültige 20 & mgr; l Lösung herzustellen. Den Thermocycler Bedingungen für die RT. Ein allgemeiner Zustand sind: Schritt 1: 25 ° C für 5 min; Schritt 2: 42 ° C für 30 min; Schritt 3: 85 ° C für 5 min; Schritt 4: Halten bei 4 ° C. Verdünnen Sie die cDNA 5 mal. Für die kurzfristige Lagerung, speichern Sie die cDNA bei 4 ° C. Für die Langzeitlagerung gefrier die cDNA bei -20 ° C.
8. Analysieren Sie den IL - 6 - Gen - Expression in der cDNA durch real-time PCR und normalisieren die IL - 6 - Genexpression zu ß-Actin - Genexpression.
   1. Machen Sie einen Master - Mix für IL - 6 und β-Actin - Erkennung. Verwenden Sie 25 ul Reaktion, die Master - Mix für jedes Gen enthält 12,5 ul SYBR Green Mix, 0,5 ul 10 uM Vorwärtsprimer, 0,5 ul 10 uM Reverse - Primer und 6,5 ul Nuklease-freies H ₂ O.
   2. Platz 5 ul 5x verdünnt cDNA eint die Unterseite des Brunnens von optischen 96-Well-Reaktionsplatte. Je 20 ul Master-Mix in jede Vertiefung eine endgültige 25 & mgr; l PCR-Mix zu machen. Verdreifachen jedes Gen für jede Probe. Verschließen Sie die Platte durch eine optische Klebefolie verwendet wird. Spin down die Platte bei 800 × g für 3 min bei 4 ° C Verwenden Sie das Standardprogramm von real-time PCR: Schritt 1: 50 ° C für 2 min; Schritt 2: 95 ° C für 10 min; Schritt 3: 40 Zyklen von 95 ° C für 15 sec und die Temperatur 60 ° C für 1 min. Fügen Sie einen zusätzlichen Schritt für -Dissoziationskurve.

Untersuchen 10. die Verhaltensauffälligkeiten in MIA Erwachsene Kinder (Optional):

1. Führen Sie die Verhaltenstests im Alter von 8-12 Wochen. Ändern Sie den Käfig Bettwäsche mindestens 3 Tage vor dem Test. Akklimatisieren die Mäuse auf die Verhaltenstestraum mindestens 30 min vor dem Test.
2. Für Präpulsinhibition (PPI), hemmen die Mäuse in Plexiglaszylinder mit einem piezoelektrischen Sensor darunter. Akklimatisieren die Mäuse auf die PPIKammer für 5 min. Setzen Sie die Mäuse mit 6 Studien mit 120 dB weißes Rauschen (Schreckhaftigkeit).
3. Dann setzen die Mäuse mit randomisierten Mischungen von 14 Studien von Hintergrundgeräuschen, 14 Studien mit Startle, 14 Studien mit Prepuls 5 dB (5 dB höher als Hintergrundrauschen) + Startle (PPI5) und 14 Studien mit Prepuls 15 dB (15 dB höher als Hintergrundrauschen + Startle (PPI15).
4. Der Mittelwert der Schreckhaftigkeit für die ersten 6 Studien von 120 dB Studien. Der Mittelwert der Schreckhaftigkeit für die anderen einzelnen Stimulationen. Covert den Wert auf Präpulsinhibition durch (Startle - PPI5 oder PPI15) / Startle.
5. Für Open-Feldtest, legen Sie die Maus in die Ecke eines offenen Platz Arena (50 x 50 x 50 cm ^3). Notieren Sie sich die Flugbahn der Maus für 10 min durch eine Decke montierten Kamera. Definieren Sie die Mitte der Arena als der mittleren Zone (17 x 17 cm ^2). Quantifizieren Sie die zurückgelegte Strecke, Mittelzone Einträge und Zeit in Mittelzone verbracht manuell oder durch bildbasierte automatische Analyse-Software.
6. Für Marmor Vergraben Test akklimatisieren Sie die Maus auf einen Testkäfig mit Druck 5cm tief, sauber, Aspen Kiefer Betten für 10 min. Bringen Sie die Maus auf seine homecage. Sanft legen Sie 20 marineblau 1,5 cm Durchmesser Glasmurmeln in der Art und Weise von 4 x 5-Anordnung. Platzieren Sie die Maus zurück in den Testkäfig mit Murmeln für 10 min. Zählen Sie die Murmeln, die in der 10 min Prüfdauer begraben wurde.

11. Überprüfen Sie die Zerebelläre Neuropathologie in MIA Erwachsene Kinder (Optional):

1. Euthanize die Saline und MIA erwachsenen Nachkommen von Betäubungsmittel. Perfundieren die Maus mit 50 ml PBS und anschließend 50 ml 4% Paraformaldehyd durch die Herz-Kreislauf-System.
2. Entfernen Sie das Gehirn sorgfältig und Postfix das Gehirn in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C. Spülen Sie das Gehirn mit PBS dreimal und speichern das Gehirn in PBS mit 0,02% Natriumazid in einem 4 ° C Kühlschrank bis zur Verwendung.
   HINWEIS: Das nachfixiert Gehirn kann in PBS mit 0,02% sod gespeichert werdenium Azid im Kühlschrank für bis zu einem Monat.
3. Abschnitt das Gehirn in 50 & mgr; m dünne Scheiben sagittal mit Vibratom. Sammeln Sie die Gehirnschnitte mit einem weichen Pinsel Stift. Beenden Sie die endogene Peroxidase-Aktivität durch die Abschnitte in 0,6% Wasserstoffperoxid für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Inkubieren der Abschnitte in anti-Calbindin Antikörper in Blockierungspuffer (10% Ziegenserum mit 0,1% Triton X-100 und 0,02% Natriumazid in PBS) verdünnt, über Nacht bei Raumtemperatur. Dann Inkubieren der Abschnitte in entsprechende in biotinylierter sekundärer Antikörper verdünnt Puffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert.
5. Inkubieren der Abschnitte in Avidin DH - biotinylierter Peroxidase-Komplex H-Puffer des Biotin für 1 Stunde bei Raumtemperatur zu detektieren. Entwickeln Sie die Abschnitte durch Peroxidase-Substrat mit dem Antigen zu visualisieren. Waschen der Schnitte mit PBS dreimal zwischen den Schritten. Montieren Sie die Schnitte auf Objektträger. Bild die Abschnitte unter dem Mikroskop.

Ergebnisse

Die Injektion von 20 mg / kg Poly (I: C) bei E12,5 konnte eine akute Entzündungsreaktion in der mütterlichen Plazenta-fetale Achse hervorrufen und eine chronische Wirkung auf die Entwicklung des Gehirns und Verhaltens - Phänotypen ^12,13 auszufällen. Erhöhte Niveaus eines proinflammatorischen Cytokin, Interleukin (IL) -6, ist ein zuverlässiger Indikator einer akuten Entzündungsreaktion nach MIA. Die Spitzenzeit für IL6 Genexpression in der Plazenta und f?...

Diskussion

MIA Induktion zu unterschiedlichen Zeitfenstern stört unterschiedliche Entwicklung des Gehirns Ereignisse bei Nagern und folglich führt zu unterschiedlichen Verhaltensstörungen und Neuropathologien bei den Nachkommen. Hier beschrieben wir ein Protokoll zu induzieren MIA in Mäusen, die mit Poly (I: C) Injektion an E12.5. Diese Methode der MIA Induktion führt zu Verhaltens, neurologische, immunologische und Magen - Darm - Anomalien im Zusammenhang mit Autismus und Schizophrenie bei den Nachkommen ^8,10,11,16.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt	SIGMA	P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP	HOSPIRA	NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 mL 29G x 1/2"	COVIDIEN	8881600145
50 ml conical screw cap tubes	USA SCIENTIFIC	1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer	THERMO SCIENTIFIC	1000	Optional
Stereomicroscope	Wild Heerbrugg	M5A	Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06mm	Roboz	RS-5045	Optional
RNAlater RNA stabilization reagent	Qiagen	76104	Optional
TRIzol reagent	Life Technologies	15596-026	Optional
RQ1 Rnase-free DNase	Promega	M610A	Optional
iScript cDNA synthesis kit	Bio-Rad	170-8891	Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX	Roche	4913922001	Optional
Real-time PCR	ABI	7300	Optional
Primer: Il6 forward	Life Technologies	TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC	Optional
Primer: Il6 Reverse	Life Technologies	TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC	Optional
Primer: beta-actin forward	Life Technologies	AGAGGGAAATCGTGCGTGAC	Optional
Primer: beta-actin Reverse	Life Technologies	CAATAGTGATGACCTGGCCGT	Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate	Life Technologies	4306737	Optionl
MicroAmp optical adhesive film	Life Technologies	4311971	Optionl
EthoVision	Noldus	EthoVision	Optionl
SR-LAB apparatus (PPI)	San Diego Instruments	SR-LAB	Optionl
Marbles	PENN-PLAX	Blue gem stones marbles	Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21600-069	Optionl
Paraformaldehyde	MACRON	2621-59	Optionl
Vibratome	Leica	VT1000 S	Optionl
Sodium azide	Sigma	S2002	Optionl
Triton x-100	Sigma	X100	Optionl
Hydrogen peroxide solution	Sigma	18312	Optionl
Goat serum	Vector Laboratories	S-1000	Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody	Abcam	ab11426	Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody	Vector Laboratories	BA-1000	Optionl
VECTASTAIN ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000	Optionl