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Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
基本金属在发挥正常的生物学功能,包括第二信使途径,代谢途径和细胞器的功能至关重要的作用。所有蛋白质的30%被认为是金属蛋白1和所有酶2的50%。金属酶利用这些微量金属元素作为辅助因子催化化学反应,稳定蛋白质结构和监管的角色,如第二信使。一些在问候神经变性研究最多的微量元素是铜,铁和锌3。他们被认为是参与了许多疾病的途径由dyshomeostasis在那里可以有负面影响。例如超氧化物歧化酶(SOD)直接影响寿命和家族型肌萎缩性侧索硬化症(ALS)4的转基因小鼠模型的表型的金属状态。在阿尔茨海默氏病,metalloproteomics技术已被用来发现在转的p中金属状态下降lasma 5。这些研究突出的重要作用金属蛋白可以在疾病玩。
金属蛋白直接从生物组织的研究是一个发展的领域。尽管一些金属酶已被鉴定,大部分仍然未鉴定的或未知的6。一的测量金属蛋白的主要挑战是维持蛋白质7的天然状态的要求。经典自下而上蛋白质组学技术依赖于蛋白质的消化成肽。这个过程扰乱金属及其蛋白质的非共价相互作用。因此,没有关于蛋白质的金属状态信息获得的。
克服这个问题的一种方式是通过使用尺寸排阻色谱,用感应耦合等离子体配对-质谱8,9-(SEC-ICP-MS)。这将生成有关的蛋白质的近似大小,以及信息的任何ASSOC金属iated与它10。此外,大小排阻是一个温和的色谱技术,可以保存的酶或蛋白 - 蛋白复合物的天然状态。使用感应耦合等离子体的一个优点 - 质谱(ICP-MS)是该技术的定量性质。使用一组的金属蛋白标准能够提供金属蛋白的绝对定量从生物样品9,11。这是通过在一系列金属浓度注入已知金属蛋白产生的标准曲线来实现。
这个协议表示如何可以用于各种金属蛋白标准来实现的例子。在本文中,我们的目标是为那些在生物领域主要调查金属,包括铁(Fe),铜(Cu),锌(Zn),碘(I),和钴(Co)创建标准曲线。
1.缓冲器和样品的制备
质谱 - 使用电感耦合等离子体金属蛋白标准的2散装分析
注意:这部分应在平行于该前一执行,因为它们都需要约1 - 1.5小时内完成。
4.设置和运行体积排阻 - 电感耦合等离子体 - 质谱法
注:操作步骤可能仪器和型号而有所不同。联系仪器技术专家,以了解更多有关如何配置使用的ICP-MS。
5.数据分析,处理和可视化
使用金属蛋白标准允许尺寸排阻柱进行校准。 图1A显示了洗脱曲线的标准甲状腺球蛋白铁蛋白,血浆铜蓝蛋白,铜/锌超氧化物歧化酶和基于它们结合到金属维生素B 12(铁,钴,铜,锌和I)。 图1B示出了通过的空隙体积除以基于蛋白质标准的分子量和它们的洗脱时间的大小排阻柱校准曲线,在洗脱体积的格式(Ve的提交)列(VO)。用于生成标准曲线的蛋白刀豆,伴白蛋白,血浆铜蓝蛋白,铁蛋白,超氧化物歧化酶和甲状腺球蛋白。
图2A示出铁蛋白的洗脱在一定范围的2,000 -铁60000皮克注射上柱和图2D是使 用对所述回归分析进行EAK区域; 图2B和2C是用于铜/锌超氧化物歧化酶为Cu和Zn和2E和2F的洗脱曲线使用峰面积分析产生的回归。回归分析的结果被用来在计数/秒的原始数据转换为皮克/秒这样的金属与蛋白质相关联的量可以定量。该转换是通过将线性回归(铜例如 ,334.6(计数/秒)×(秒/ PG))的斜率除以计数/秒进行。
如前所述,该技术可用于识别复杂生物样品中的金属蛋白。人脑和血浆已经经受这种技术和图3和4分别显示获得的结果。通过SEC-ICP-MS分离人脑示于图3A-3C,其每一个代表不同的金属息(铜,锌或铁)。 图4A-4C示出得到的迹线时的人血浆进行这种技术。的样品的复杂性和数量将影响那些看出峰的数目。如所预期的等离子体是通过几个金属蛋白,包括铜蓝蛋白和转铁为主。
图1. 大小排阻色谱的校准-电感耦合等离子体-质谱法使用已知金属蛋白 (A)的洗脱曲线用于基于它们各自的金属的金属蛋白标准。 (B)中对蛋白质标准甲状腺球蛋白(i)中,铁蛋白分子量校正曲线(ii)中,铜蓝蛋白(iii)中,伴清蛋白(ⅳ),铜/锌超氧化物歧化酶(v)和伴刀豆球蛋白A(ⅵ)。"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。
60000微克/升- 图2.铁和铜/锌超氧化物歧化酶金属蛋白作为标准使用过注射范围为2000 确定在复杂生物样品中的铜,铁或锌伴有金属蛋白量 (A)洗脱天寒铁蛋白。铁。 (B)和对铜/锌超氧化物歧化酶在200喷射范围(℃)洗脱资料- 6000微克/升铜和锌,分别的。 (D),(E)和(F)显示了金属铁,铜和锌的回归分析结果,分别为。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.铜,铁,人脑。(A)铜迹(B)铁痕迹锌Metalloproteome(C)锌痕迹。蛋白质标准,为每个金属洗脱被黑迹用图形表示下其分子量图所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.铜,铁,锌Metalloproteome人血浆。(A)铜迹(B)微量铁(C)锌痕迹。的蛋白质标准,为每个金属洗脱通过在黑色的跟踪其分子量示图形下方示。 请点击此处查看该图的放大版本。
确保该蛋白质的天然状态装置特别注意使用,并且所需要的样品的存储缓冲器。不是所有的色谱技术或样品制备技术可以采用。重要的是,在整个样品制备和色谱所用的缓冲器是缺乏的金属螯合剂和模仿生理pH和盐浓度使用缓冲剂。其他条件,以避免包括取暖样品或添加蛋白变性( 如尿素)的。关键是要尽量减少冻融循环的数目。所选择的缓冲器的结合二价金属的能力也很重要,并且是的Tris或硝酸铵缓冲器被选择通过基于磷酸盐缓冲剂的一个原因。
大小排阻相对于其它形式的色谱法的色谱低分辨率和峰容量是这种技术的一个主要限制。然而,尺寸排阻chromatogra的性质温和PHY重要的是要维持该蛋白质的天然状态,因而保留了相对较弱的金属 - 蛋白质结合。以保持蛋白质的天然状态的要求,需要特别注意样品包括限制冻融循环的数目的处理,避免了金属螯合剂( 例如 ,EDTA)或其离液盐和洗涤剂。
这种低的这种技术影响分辨率量化与特定蛋白相关金属的量,如果它是一个复杂的样品所见将包含一个以上的蛋白质的峰的能力。因此,金属的使用峰积分确定的量将是金属的所有的蛋白质洗脱在该时间点,而不是只是一个特定的蛋白质相关联的总数量的指示。为了克服这一限制的目的蛋白质将必须在天然条件下进一步纯化。这将允许的量化与该蛋白质相关的金属具有更高程度certainity的报告。该技术的另一种潜在的局限性是蛋白质的损失,由于非可逆结合到柱上。为了确定这是否发生一个恢复实验由此分析蛋白质脱柱洗脱的量,以确定是否该匹配喷射量应进行。同样可以通过测量洗脱材料中的金属含量并通过本体的ICP-MS起始材料来完成。列恢复可以根据所使用的条件不同,但它已经表明,从一个尺寸排阻柱蛋白质的完全恢复是可能9。因此,检查是否有正在使用的操作条件下的损失是很重要的。
修改的协议可以与所使用以及分析元件的金属蛋白标准。该型金属蛋白标准我们海关将根据自己感兴趣的内容有所不同。对于元素如铜,铁,锌的蛋白质,SOD和铁蛋白的使用。具有已知stoichometries任何其他金属蛋白也可以使用和几个例子已经在这里显示。
可以从使用这种技术产生的一个主要并发症是盐晶体中的ICP-MS的火炬积聚。千毫升缓冲液已经通过系统或当它通过肉眼检查确定该火炬应清洗 - 防止盐晶体的积聚,火炬每500后用蒸馏水洗涤。可能出现的另一个问题是在样品和提取锥的洁净度的快速下降。这些都需要定期清洗以下制造商的协议。
初始样品的准备是在协议中最关键的步骤。如果有任何改变蛋白 - 金属复合物的INFormation产生将是无效的。这是该技术的主要限制之一;除了使用低分辨率的,尺寸排阻柱产生在生物学金属蛋白的真正复杂的有限详细视图。
此处所描述的技术允许生物体的metalloproteome的知识的扩展。散装分析只给出变化的一个样品内的粗指示金属的量。除了需要加以考虑的一般因素,这种技术提供了可用于定量与蛋白质以及确定金属蛋白缔合金属的通过比较得到的迹线的不同的量的工具。利用这种技术可用于鉴定疾病状态之间的差异。在确定金属蛋白就可以进行进一步的调查,以帮助确定它们在疾病过程中发挥的作用。联用ICP-MS的应用程序都有一个成长将来,以确定可用于识别该药物结合的蛋白质具有一个杂原子的药物如铂,碘或铜作为ICP-MS中的作用。
The authors have nothing to disclose
我们要感谢来自维多利亚州政府的运营基础设施的支持计划,澳大利亚研究理事会联动项目计划(通过Agilent Technologies),澳大利亚国家卫生和医学研究理事会,维多利亚脑库,合作研究中心心理健康与Neuroproteomics支持设施。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |
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