Method Article
Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
Основные металлы играют жизненно важную роль в нормальных биологических функций, в том числе вторичных мессенджеров путей, обмена веществ путей и функции органелл. 30% всех белков , как полагают, металлопротеиды 1 и 50% всех ферментов 2. Металлоферментах использовать эти металлы в качестве следовых кофакторов катализировать химические реакции, стабилизируют структуру белка, а также для регуляторных функций, таких как вторичных мессенджеров. Некоторые из наиболее изученных микроэлементов в отношении нейродегенерации являются медь, железо и цинк 3. Считается, что они должны быть вовлечены во многих путей заболевания, где с помощью dyshomeostasis может иметь неблагоприятные последствия. Например, статус металла супероксиддисмутазы (СОД) непосредственно влияет на продолжительность жизни и фенотипа трансгенных моделей мышей семейного типа бокового амиотрофического склероза (ALS) 4. При болезни Альцгеймера, metalloproteomics методы использовались, чтобы обнаружить снижение состояния металла трансферрина в рЛАЗМА 5. Эти исследования подчеркивают важную роль, которую могут играть металлопротеиды болезни.
Изучение металлопротеинов непосредственно из биологических тканей является полем развивается. Хотя некоторые металлоэнзимами были охарактеризованы, большинство по- прежнему остаются неохарактеризованных или неизвестно 6. Одной из основных проблем при измерении металлопротеинов является требование , чтобы сохранить естественное состояние белка 7. Классическая снизу вверх протеомические методы основаны на переваривание белков в пептидов. Этот процесс приводит к нарушению нековалентную взаимодействия металлов и их белков. Таким образом, никакой информации о состоянии металла белка не достигается.
Одним из способов преодоления этой проблемы является использование эксклюзионной хроматографии в паре с индуктивно связанной плазмой - масс - спектрометрии (8,9 SEC-ICP-MS). Это генерирует информацию о приблизительный размер белка, а также любые металлы, которые Assocзанного с ним 10. Кроме того, размер исключения нежный хроматографический метод, который может сохранить естественное состояние фермента или белок-белкового комплекса. Одно из преимуществ использования с индуктивно связанной плазмой - масс-спектрометрии (МС-ИСП) является количественный характер технологии. С помощью набора стандартов металлопротеиды можно обеспечить абсолютную количественную оценку металлопротеинов из биологических образцов 9,11. Это достигается за счет создания стандартной кривой, путем введения известных металлопротеиды в диапазоне концентраций металла.
Этот протокол показывает пример того, как это может быть достигнуто для различных стандартов металлопротеины. В этой статье мы стремимся создать стандартные кривые для металлов, которые в значительной степени исследованы в биологических областях, включая железо (Fe), меди (Cu), цинк (Zn), йод (I) и кобальта (Co).
1. Подготовка буферов и образцов
2. Объемная Анализ металлопротеины стандартов с использованием индуктивно связанной плазмы - масс-спектрометрия
Примечание: Этот раздел должен выполняться параллельно с предыдущим, так как они оба требуется около 1 - 1,5 ч, чтобы закончить.
4. Настройка и запуск гельпроникающей - индуктивно связанной плазмой - Масс-спектрометрия
Примечание: Рабочие процедуры могут варьироваться в зависимости от инструментов и моделей. Обратитесь к техническому специалисту инструмент, чтобы узнать больше о том, как настроить ICP-MS используется.
5. Анализ данных, манипулирование и визуализация
Использование стандартов металлопротеины позволяет для калибровки колонки вытеснительной. Рисунок 1A показывает профиль элюирования для стандартов тиреоглобулина, ферритина, церулоплазмина, Cu / Zn СОД и витамина B 12 на основе металла , что они связаны с (Fe, Со, Cu, Zn и I). на рисунке 1В показывает калибровочную кривую для колонки вытеснительной на основе молекулярной массы белковых стандартов и их времени элюирования, представленные в формате объема элюирования (Ve) , разделенное на объем пустот колонка (Vo). Белки, используемые для создания этой стандартной кривой конканавалином А, conalbumin, церулоплазмин, ферритин, СОД и тиреоглобулина.
На фиг.2А показана элюирование ферритина в диапазоне 2000 - 60000 мкг Fe впрыскивается на колонке и рис 2D является регрессионный анализ , проведенный с использованием пEAK площадь. На рисунках 2В и 2С являются профили элюции для Cu / Zn СОД для Cu и Zn и 2E и 2F являются регрессионный анализ генерируется с использованием площадей пиков. Результаты регрессионного анализа используются для преобразования исходных данных в число импульсов / с до пг / сек, так что количество металла, связанный с белком может быть определено количественно. Преобразование выполняется путем деления число импульсов / с наклоном линейной регрессии (например, 334,6 (число импульсов / с) х (сек / пг) из меди).
Как уже говорилось, эта техника может быть использована для идентификации металлопротеиды в сложных биологических образцах. Человеческий мозг и плазма были подвергнуты этой технике и рисунках 3 и 4, соответственно, показывают результаты , полученные. Человеческий мозг разделены SEC-ИСП-МС показано на фигурах 3А-3С, каждый из которых представляет различный металл интерес (Cu, Zn или Fe). На фиг.4А-4С показаны следы , полученные из плазмы человека , когда подвергается этой технике. Сложность и обилие образца окажет влияние на число пиков, которые видны. Как и следовало ожидать плазмы доминируют несколько металлопротеинов включая церулоплазмина и трансферрина.
Рисунок 1. Калибровка вытеснительной хроматографии - индуктивно связанной плазмой - масс - спектрометрия с использованием известных профиль металлопротеиды (А) элюции стандартов металлопротеины на основе их соответствующих металлов.. (Б) Молекулярная масса калибровочной кривой для белковых стандартов тиреоглобулина (I), ферритин (II), церулоплазмина (III), conalbumin (IV), Cu / Zn СОД (V) и конканавалин А (VI)."Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Использование ферритина и Cu / Zn СОД как металлопротеины стандартов для определения количества Cu, Fe или Zn , связанных с металлопротеиды в комплексной биологической пробе (A) Профиль элюции для ферритина в диапазоне впрыска 2000 -. 60 000 мкг / л железа. (В) и (С) Профиль элюции для Cu / Zn СОД в диапазоне инжекции 200 - 6000 мкг / л меди и цинка, соответственно. (D), (Е) и (F) показывают результаты регрессионного анализа для металлов железа, меди и цинка, соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Cu, Fe и Zn Metalloproteome человеческого мозга. (A) Медь след (B) Железный след (C) Цинковый след. Элюции белковых стандартов для каждого металла показан черным следом с их молекулярной массой , указанной под графиком. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Cu, Fe и Zn Metalloproteome для человеческой плазме. (A) Медь след (B) Железный след (C) Цинковый след. Элюции белковых стандартов для каждого металла показана черным следом с их молекулярной массойпод показаны , графика. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Обеспечение нативного состояния белка означает особое внимание используемых буферов и хранения образца необходимы. Не могут быть использованы все методы хроматографии или методы подготовки образца. Важно, что буферы, используемые в пробоподготовки и хроматографии, лишены металлических энтеросорбенты и используют буферы, которые имитируют физиологические концентрации рН и соли. Другие условия , чтобы избежать включают нагревание образца или добавление белка денатурирующих (например, мочевина). Крайне важно, чтобы свести к минимуму количество циклов замораживания-оттаивания. Способность выбранного буфера для связывания двухвалентных металлов также имеет важное значение и является причиной того, что Трис или аммония нитрата буферы выбираются через буферы на основе фосфатов.
Низкое разрешение и пик емкость вытеснительной хроматографии по сравнению с другими формами хроматографии является основным ограничением этого метода. Тем не менее, нежная природа вытеснительной хроматогPHY важно поддерживать естественное состояние белка и, таким образом, сохранить относительно слабые металл-белковых связей. Требование , чтобы сохранить естественное состояние белков требует особого внимания к обработке образцов , включая ограничение числа циклов замораживания - оттаивания, избегая металлических энтеросорбенты (например, ЭДТА) или хаотропные соли и моющих средств.
Это низкое разрешение этой методики воздействий способность определить количество металла, связанного с конкретным белком, если он находится в сложном образце, что и пики видно будет содержать более одного белка. Таким образом, количество металла, определяется с использованием пиковой интеграции может быть показателем общего количества металла, связанного со всеми белками элюирование в этот момент времени, а не только один конкретный белок. Для того, чтобы преодолеть это ограничение интересующий белок должен был бы быть дополнительно очищен при нативных условиях. Это позволило бы квантификацииметалл, связанный с этим белком, чтобы сообщаться с более высокой степенью certainity. Еще одним потенциальным недостатком этой методики было бы потери белка из-за необратимое связывание с колонкой. Для того, чтобы определить, является ли это происходит эксперимент восстановления следует проводить в результате чего количество белка при элюировании из колонки анализируют, чтобы определить, совпадает ли этот объем впрыскиваемого. То же самое можно сделать путем измерения содержания металла элюции материала и исходный материал и навальным ICP-MS. Восстановление столбца может отличаться в зависимости от используемых условий, но было показано , что полное восстановление белков из колонки вытеснительной возможно 9. Таким образом, важно, чтобы проверить, действительно ли существует какой-либо потери в рабочих условиях используется.
Изменения в протоколе могут быть связаны со стандартами металлопротеины, которые используются, а также анализируемых элементов. Тип металлопротеины стандарт СШАе изд будет отличаться в зависимости от элементов, представляющих интерес. Для таких элементов, как Cu, Fe и Zn белков, СОД и ферритина используются. Любые другие металлопротеины, которые имеют известные stoichometries также могут быть использованы и несколько примеров было показано здесь.
Одним из основных осложнений, которые могут возникнуть в результате использования этого метода является нарастание кристаллов соли в факелом ICP-MS. Для того, чтобы предотвратить накопление кристаллов соли, факел промывают дистиллированной водой каждые 500 - 1000 мл буфера, который был пропущен через систему или когда определено путем визуального осмотра, что факел должны быть вымыты. Другая проблема, которая может возникнуть является более быстрое снижение чистоты образца и экстракции конусов. Их необходимо регулярно чистить следующие протоколы производителя.
Первоначальная подготовка образца является самым важным шагом в протоколе. Если есть какие-либо изменения в белке - металлический комплекс РСМДormation генерируется не будет действительным. Это одно из основных ограничений техники; Кроме того, использование низкого разрешения, колонка эксклюзионной дает ограниченное детальное представление об истинной сложности металлопротеинов в биологии.
Техника, описанная здесь, позволяет расширить знания metalloproteome организма. Bulk анализ дает только грубую индикацию изменения в количестве металла в образце. Помимо общих соображений, которые необходимо принимать во внимание, этот метод дает инструмент, который может быть использован для количественного определения количества металла, связанного с белками, а также определения металлопротеинов, которые отличаются путем сравнения полученных следов. Использование этого метода может быть использована, чтобы определить различия между болезненными состояниями. Выявленные металлопротеиды затем могут быть дополнительно исследованы, чтобы помочь определить роль, которую они играют в процессах болезни. Применение дефис ICP-MS имеет растущуюбудущее, чтобы определить роль лекарственных средств, имеющих гетероатом, такой как платина, йод или медь в качестве ИСП-МС может быть использован для идентификации белков, который связывает лекарственное средство.
The authors have nothing to disclose
Мы хотели бы отметить поддержку со стороны викторианского правительства Операционной программы Инфраструктура поддержки, Австралийский исследовательский совет Linkage Проекты Схема (с Agilent Technologies), австралийского исследовательского центра Национального Совета по медицинским исследованиям, викторианская мозга банка, здравоохранения и кооперативной психического здоровья и Neuroproteomics объект.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены