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Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
metalli essenziali svolgono un ruolo fondamentale nelle funzioni biologiche normali, tra cui percorsi di messaggistica secondarie, percorsi del metabolismo e le funzioni degli organelli. Il 30% di tutte le proteine sono pensato per essere metalloproteine 1 e il 50% di tutti gli enzimi 2. Metalloenzimi utilizzano questi metalli in tracce come cofattori di catalizzare reazioni chimiche, stabilizzare la struttura delle proteine, e per i ruoli di regolamentazione, come messaggeri secondari. Alcuni degli oligoelementi più studiati con riferimento a neurodegenerazione sono rame, ferro e zinco 3. Si pensa di essere coinvolti in molte vie malattia in cui da dyshomeostasis può avere effetti negativi. Per esempio lo stato di metallo di superossido dismutasi (SOD) direttamente gli impatti del ciclo di vita e il fenotipo dei modelli di topi transgenici di tipo familiare di sclerosi laterale amiotrofica (SLA) 4. Nella malattia di Alzheimer, metalloproteomics tecniche sono state utilizzate per scoprire una diminuzione dello stato metallico di transferrina in pLasma 5. Questi studi evidenziano le importanti metalloproteine ruolo possono giocare nella malattia.
Lo studio di metalloproteine direttamente dai tessuti biologici è un campo in via di sviluppo. Anche se alcuni metalloenzimi sono stati caratterizzati, la maggior parte rimane ancora indefinita o sconosciuti 6. Una delle principali sfide in metalloproteine di misura è l'obbligo di mantenere lo stato nativo della proteina 7. Classica bottom-up tecniche di proteomica si basano sulla digestione delle proteine in peptidi. Questo processo interrompe l'interazione non covalente di metalli e loro proteine. Quindi, nessuna informazione sullo stato di metallo di una proteina è guadagnato.
Un modo per superare questo problema è quello di utilizzare la cromatografia dimensione esclusione in coppia con plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa 8,9 (SEC-ICP-MS). Questo genera informazioni sulla dimensione approssimativa della proteina così come tutti i metalli che sono assocIATED con esso 10. Inoltre, l'esclusione dimensioni è una delicata tecnica cromatografica che può preservare lo stato nativo di un complesso enzimatico o proteina-proteina. Un vantaggio di utilizzare plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa (ICP-MS) è la natura quantitativa della tecnologia. Utilizzando un insieme di standard metalloproteine è possibile fornire quantificazione assoluta di metalloproteine da campioni biologici 9,11. Questo risultato è ottenuto generando una curva standard iniettando metalloproteine noti in un range di concentrazioni di metalli.
Questo protocollo mostra un esempio di come questo può essere realizzato per una varietà di standard metalloproteine. In questo articolo ci proponiamo di creare curve standard per i metalli che sono in gran parte studiati nei campi biologici tra cui ferro (Fe), rame (Cu), zinco (Zn), iodio (I), e il cobalto (Co).
1. Preparazione di buffer e Campioni
2. Analisi di massa di metalloproteine Standards Utilizzando plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa
Nota: Questa sezione deve essere eseguita in parallelo al precedente, poiché entrambi necessari circa 1-1,5 ore per completare.
4. creazione e la gestione Size Exclusion - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa
Nota: le procedure operative possono variare tra gli strumenti e modelli. Contatta lo specialista tecnico dello strumento per ulteriori informazioni su come configurare la ICP-MS in uso.
5. Analisi dei dati, manipolazione e visualizzazione
L'uso di standard metalloproteine consente la taratura della colonna esclusione dimensionale. Figura 1A mostra il profilo di eluizione per gli standard tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD e vitamina B 12 in base al metallo che essi sono tenuti a (Fe, Co, Cu, Zn e I). Figura 1B mostra la curva di calibrazione per la colonna esclusione dimensionale in base al peso molecolare degli standard proteine e il loro tempo di eluizione, presentata nel formato di volume di eluizione (Ve) diviso per il volume vuoto della colonna (Vo). Le proteine utilizzate per generare questa curva standard sono Concanavalina A, conalbumina, ceruloplasmina, ferritina, SOD e tireoglobulina.
La Figura 2A mostra l'eluizione di ferritina su una gamma di 2.000 - 60.000 pg di Fe iniettato su colonna e la figura 2D è l'analisi di regressione effettuata utilizzando pzona eak. Figure 2B e 2C sono i profili di eluizione per Cu / Zn SOD per Cu e Zn e 2E e 2F sono l'analisi di regressione generata utilizzando aree dei picchi. I risultati dell'analisi di regressione sono utilizzati per convertire i dati grezzi in conteggi / sec a pg / sec modo la quantità di metallo associati con la proteina può essere determinata quantitativamente. La conversione viene eseguita dividendo il conteggi / sec dalla pendenza della regressione lineare (ad esempio, 334,6 (conteggi / sec) x (sec / pg) di rame).
Come detto, questa tecnica può essere utilizzata per identificare metalloproteine in campioni biologici complessi. Il cervello umano e nel plasma sono stati sottoposti a questa tecnica e le figure 3 e 4, rispettivamente, mostrano i risultati ottenuti. Il cervello umano separati da SEC-ICP-MS è mostrato nelle figure 3A-3C, ciascuna delle quali rappresenta un metallo diverso interesse (Cu, Zn o Fe). Figure 4A-4C mostrano le tracce ottenute quando plasma umano è sottoposto a questa tecnica. La complessità e l'abbondanza del campione avrà un impatto sul numero di picchi che si vedono. Come previsto il plasma è dominato da un paio di metalloproteine tra ceruloplasmina e transferrina.
Figura 1. La calibrazione del Size Exclusion Chromatography - plasma accoppiato induttivamente - spettrometria di massa Utilizzando noto profilo di Metalloproteine (A) eluizione per gli standard di metalloproteine in base alle loro rispettive metalli.. (B) della curva di taratura di peso molecolare per gli standard di proteine tiroglobulina (i), ferritina (ii), ceruloplasmina (iii), conalbumina (iv), Cu / Zn SOD (v) e concanavalina A (vi)."Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Utilizzo della ferritina e Cu / Zn SOD come metalloproteine standard per determinare la quantità di Cu, Fe o Zn associati con Metalloproteine in un campione biologico complesso (A) profilo di eluizione per ferritina nel range di iniezione di 2.000 -. 60.000 mg / L di ferro. (B) e (C) il profilo di eluizione per Cu / Zn SOD nell'intervallo di iniezione di 200 - 6.000 mg / L rispettivamente rame e zinco,. (D), (E) e (F) mostrano i risultati dell'analisi di regressione per i metalli di ferro, rame e zinco, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Cu, Fe e Zn Metalloproteome del cervello umano. (A) traccia di rame (B) traccia di ferro (C) Zinco traccia. Eluizione degli standard di proteine per ogni metallo è indicato dalla traccia nera con il loro peso molecolare, indicato sotto il grafico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Cu, Fe e Zn Metalloproteome per il plasma umano. (A) traccia di rame (B) traccia di ferro (C) Zinco traccia. Eluizione delle norme proteiche per ciascun metallo è indicato dalla traccia nera con il loro peso molecolaredicato sotto il grafico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Assicurare lo stato nativo della proteina significa particolare attenzione ai buffer utilizzati e sono necessarie conservazione del campione. Non tutte le tecniche di cromatografia o tecniche di preparazione dei campioni possono essere impiegate. È importante che i buffer utilizzati durante la preparazione del campione e la cromatografia sono privi di chelanti di metalli e utilizzare buffer che imitano le concentrazioni di pH e di sale fisiologico. Altre condizioni da evitare sono il riscaldamento del campione o l'aggiunta di proteine denaturanti (ad esempio, urea). È fondamentale per minimizzare il numero di cicli di gelo-disgelo. La capacità del buffer scelto di legare metalli bivalenti è importante e una ragione che Tris o ammonio nitrato buffer sono scelti fra i respingenti base di fosfato.
La risoluzione e bassa capacità di picco della cromatografia ad esclusione sterica rispetto ad altre forme di cromatografia è un grosso limite di questa tecnica. Tuttavia, la natura gentile di dimensioni esclusione crPHY è importante mantenere lo stato nativo della proteina e quindi preservare i legami metallo-proteina relativamente deboli. Il requisito per mantenere lo stato originario delle proteine richiede una particolare attenzione al trattamento dei campioni anche limitare il numero di cicli di gelo-disgelo, evitando chelanti di metalli (ad esempio, EDTA) o sali caotropici e detergenti.
Questa bassa risoluzione di questa tecnica influenzano la capacità di quantificare la quantità di metallo associato con una proteina specifica se è in un campione complesso come i picchi osservati conterrà più di una proteina. Pertanto, la quantità di metallo determinato con l'integrazione dei picchi sarebbe un'indicazione della quantità totale di metallo associati con tutte le proteine eluendo a questo punto di tempo e non solo una proteina specifica. Per superare questa limitazione della proteina di interesse dovrebbe essere ulteriormente purificato in condizioni native. Ciò consentirebbe per la quantificazione diil metallo associato a questa proteina da segnalare con un più alto grado di Certezza. Un altro potenziale limite di questa tecnica sarebbe la perdita di proteine dovuta al legame reversibile non alla colonna. Al fine di determinare se questo accade un esperimento di recupero deve essere effettuata per cui la quantità di proteine eluizione largo della colonna viene analizzato per determinare se questo corrisponde alla quantità iniettata. Lo stesso può essere fatto misurando il contenuto di metallo del materiale eluizione e il materiale di partenza da massa ICP-MS. Recupero colonna può variare a seconda delle condizioni utilizzate, ma è stato dimostrato che il recupero completo di proteine da una colonna dimensioni esclusione è possibile 9. Pertanto è importante controllare se vi è alcuna perdita nelle condizioni operative utilizzate.
Le modifiche al protocollo possono essere correlati agli standard metalloproteine che vengono utilizzati, così come gli elementi analizzati. Il tipo di metalloproteine standard degli Stati UnitiEd sarà diverso a seconda degli elementi che sono di interesse. Per elementi come Cu, Fe e Zn proteine, SOD e ferritina sono impiegati. Qualsiasi altro metalloprotein che hanno stoichometries noti può essere utilizzato e alcuni esempi sono stati qui mostrato.
Una complicazione maggiore che può derivare dall'uso di questa tecnica è la formazione di cristalli di sale nella torcia della ICP-MS. Per impedire la formazione di cristalli di sale, la torcia viene lavata con acqua distillata ogni 500 - 1,000 ml di tampone che è stato passato attraverso il sistema o quando viene determinato mediante ispezione visiva che la torcia deve essere lavato. Un altro problema che può sorgere è un rapido declino più nella pulizia dei coni campione ed estrazione. Questi devono essere puliti regolarmente seguendo i protocolli del produttore.
La preparazione del campione iniziale è la fase più critica nel protocollo. Se ci sono eventuali modifiche alla proteina - il complesso metallico informazione generato non sarà valida. Questo è uno dei principali limiti della tecnica; inoltre l'uso della bassa risoluzione, colonna esclusione dimensionale produce una vista dettagliata limitata della vera complessità delle metalloproteine in biologia.
La tecnica qui descritta permette l'espansione della conoscenza del metalloproteome di un organismo. analisi Bulk dà solo un'indicazione grezza di modifiche alla quantità di metallo in un campione. Oltre alle considerazioni generali che devono essere presi in considerazione, questa tecnica fornisce uno strumento che può essere usato per quantificare la quantità di metallo associati con proteine e metalloproteine identificazione che differiscono confrontando i tracciati ottenuti. L'uso di questa tecnica può essere utilizzata per identificare le differenze tra stati di malattia. Le metalloproteine identificate possono poi essere ulteriormente studiati per aiutare a determinare il ruolo che svolgono nei processi di malattia. L'applicazione di un trattino ICP-MS ha una crescitafuturo per determinare il ruolo dei farmaci che hanno un eteroatomo come platino, iodio o rame come ICP-MS può essere utilizzato per identificare le proteine che il farmaco si lega.
The authors have nothing to disclose
Vorremmo riconoscere il sostegno del programma del Governo del Victoria Operativa Infrastrutture di supporto, il collegamento Progetti Scheme (con Agilent Technologies) Australian Research Council, l'Australian Research Centre Cooperative National Health and Medical Research Council, la banca del cervello vittoriana, per la salute mentale e il Neuroproteomics servizio, struttura.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |
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