Estándares para el Análisis Cuantitativo de Metalloproteomic Uso de exclusión por tamaños ICP-MS

Resumen

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Resumen

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Introducción

metales esenciales desempeñan un papel vital en las funciones biológicas normales, incluyendo las vías mensajeras secundarias, vías de metabolismo y las funciones de los orgánulos. 30% de todas las proteínas se cree que son metaloproteínas ¹ y 50% de todas las enzimas ^2. Metaloenzimas utilizan estos metales traza como cofactores para catalizar reacciones químicas, estabilizar la estructura de proteínas, y para las funciones de regulación, tales como mensajeros secundarios. Algunos de los elementos traza más estudiados en lo que respecta a la neurodegeneración son el cobre, el hierro y el zinc ^3. Se cree que participan en muchas vías de la enfermedad, donde por dyshomeostasis puede tener efectos adversos. Por ejemplo el estado de metal de la superóxido dismutasa (SOD) directamente afecta a la duración de la vida y el fenotipo de los modelos de ratones transgénicos de tipo familiar de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) ^4. En la enfermedad de Alzheimer, metalloproteomics técnicas se han utilizado para descubrir una disminución en el estado de metal de transferrina en pLasma ^5. Estos estudios ponen de relieve las metaloproteínas importante papel que pueden desempeñar en la enfermedad.

El estudio de metaloproteínas directamente de los tejidos biológicos es un campo en desarrollo. Aunque algunos metaloenzimas se han caracterizado, la mayoría todavía permanecen sin caracterizar o desconocido ^6. Uno de los principales retos en metaloproteínas de medición es el requisito para mantener el estado natural de la proteína ^7. Classical abajo arriba técnicas proteómicas se basan en la digestión de las proteínas en péptidos. Este proceso altera la interacción no covalente de metales y sus proteínas. Por lo tanto, se obtiene ninguna información sobre el estado de metal de una proteína.

Una forma de superar este problema es mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño se combina con plasma acoplado inductivamente - ^8,9 espectrometría de masas (SEC-ICP-MS). Esto genera información sobre el tamaño aproximado de la proteína, así como de todos los metales que son Associated con él ^10. Además, la exclusión de tamaño es una técnica cromatográfica suave que puede preservar el estado natural de un complejo de enzima o proteína-proteína. Una de las ventajas de la utilización de plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (ICP-MS) es la naturaleza cuantitativa de la tecnología. El uso de un conjunto de normas de metaloproteínas es posible proporcionar la cuantificación absoluta de metaloproteínas de muestras biológicas ^9,11. Esto se logra mediante la generación de una curva estándar mediante la inyección de metaloproteínas conocidos en un intervalo de concentraciones de metales.

Este protocolo muestra un ejemplo de cómo esto puede lograrse por una variedad de normas de metaloproteínas. En este trabajo pretendemos crear las curvas de calibración para los metales que son investigados en gran medida en los campos biológicos, incluyendo el hierro (Fe), cobre (Cu), zinc (Zn), yodo (I) y cobalto (Co).

Protocolo

1. Preparación de tampones y muestras

1. Preparar 500 ml de tampón, 200 mM de nitrato de amonio de pH 7.6 a 7.8 (pH ajustado con hidróxido de amonio (NH ₄ OH)) con cesio (Cs) y antinomia (Sb) a una concentración final de 10 ppb. Utilice cesio y antinomia como patrones internos para controlar cualquier desviación en la respuesta de ICP-MS. tampón de filtro antes de su uso a través de un filtro de 0,22 micras.
2. Preparar la muestra en función del tipo de muestra: líquido, tejido o cultivo celular.
   1. Para las muestras que requieren la homogeneización (por ejemplo, tejido o células), asegurarse de que no contienen detergente. Utilizar tampones Tris para la preparación de la muestra. Como alternativa, utilizar tampones de fosfato pero pueden afectar negativamente a la metalloproteome con el tiempo o con los ciclos de congelación y descongelación ^12.
   2. Homogeneizar de tejido o cultivo de células de las muestras por Dounce manual o sonicación durante 5 min usando Tris solución salina tamponada (50 mM Tris pH 8,0, cloruro de sodio 150 mM(NaCl) + ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) inhibidores de la proteasa libres).
   3. Aclarar homogeneizados por centrifugación a 16.000 xg durante 5 min. Recoger el sobrenadante resultante. Mantener las muestras a 4 ° C.
      Nota: Todas las muestras deben ser centrifugadas antes de cargar en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) viales para evitar que las partículas de bloquear la columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
3. Normalizar la cantidad total de proteína cargada en la columna a través de las muestras. Determinar las concentraciones de proteína a 280 nm utilizando un espectrofotómetro UV micro volumen ^13. De carga entre 20 y 150 g de proteína. Utilice volúmenes de inyección típicos que van desde 2 hasta 80 l dependiendo de la concentración de la muestra.
   1. Limpiar el brazo de muestra del espectrofotómetro UV micro volumen con agua destilada antes de la carga de la muestra. El brazo de muestra es donde se cargan las muestras de proteínas.
   2. En blanco el instrumento frente a 2 l de THtampón de muestra e. Entonces, la carga 2 l de cada muestra en el brazo y medir la absorbancia a 280 nm.
   3. Determinar las concentraciones. Para las muestras de proteína cruda, utilizar un coeficiente de extinción de 1 Abs = 1 mg / ml. Para determinar la concentración de proteína en las muestras, utilizar la ley de Beer-Lambert, A = ε xlxc, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción, l es la longitud de la trayectoria en centímetros y c es la concentración.

2. Análisis de las Normas granel metalloprotein El uso de plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas

1. Calentamiento y afinar el instrumento utilizando los protocolos del fabricante.
2. Una vez instrumento se calienta y afinado, realice mayor ICP-MS.
   Nota: Las soluciones madre de metaloproteínas purificados generalmente necesitan ser diluidas antes de la medición. La concentración de metal de la norma puede estimarse a partir de la proteína conocida: stochiometries de metal y la concentración de proteína estimadación. Esta información se puede utilizar para determinar la dilución que será apropiado para caer dentro del rango de la curva estándar generada.
   1. Diluir normas metaloproteínas, tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD y vitamina B _12, para asegurar que caen dentro del rango de 0 - 500 g / L, usando ácido nítrico 1%. Para alcanzar los estándares dentro de este rango, no utilice diluciones superiores a 1 en 20. Realizar diluciones seriadas en agua para diluir las existencias antes de esto, si es necesario.
   2. Configurar el orden de las inyecciones. En primer lugar, analizar los siete niveles de calibración, concentraciones que van desde 0 hasta 500 g / L, seguidos por los estándares de metaloproteínas. Los siete niveles de calibración son 0, 1, 5, 10, 50, 100 y 500 g / L.
   3. Seleccionar elementos de interés. A continuación, utilice Fe, Cu, Zn, Co y yo, ya que son los elementos que los patrones de proteínas están obligados a. Seleccionar los elementos en el método de adquisición mediante la apertura de la pestaña selector de elementos y agregando el eleme NTS y ​​sus respectivas masas de isótopos que se van a analizar.
   4. Realizar análisis de la muestra con el instrumento y el software del instrumento crea automáticamente las curvas de calibración para cada uno de los elementos que se analiza. Las curvas de calibración son creados por el software mediante el trazado de la cuentas / s del metal detectado en contra de la cantidad de metal que la norma está destinado a contener, en mg / l. Usar las curvas de calibración para determinar la concentración de metal en las muestras desconocidas.
      Nota: El uso de la curva de calibración, el software determina la concentración de metal en cada una de las normas de metaloproteínas.
   5. De los resultados del análisis a granel, generar normas metaloproteínas que incluyen los tres elementos traza más abundantes en los tejidos de mamíferos usando una mezcla de Cu, Zn superóxido dismutasa (SOD) se diluyó a 200 mg / L de cobre y zinc y ferritina (FTN) en una final concentración de 2,000 mg / L de hierro.

jove_title "> 3. Configuración del sistema HPLC de exclusión por tamaños y cromatografía en columna de equilibrado

Nota: Esta sección debe realizarse de forma paralela a la anterior, ya que ambos requieren cerca de 1 - 1,5 horas para completar.

1. Bombas de purga HPLC con tampón realizada en el paso 1.1 y purgar las bombas para 5 min a una velocidad de flujo de 5 ml / min.
2. Una vez que el sistema se purga, establecer la velocidad de flujo de 0,1 ml / min y conectar la columna de exclusión de tamaño (4,6 x 300 mm, 3 m, 150 Å).
   Nota: Una conexión húmedo entre el tubo y la columna evita las burbujas de aire están atrapadas durante la conexión de la columna.
3. Conectar el extremo opuesto de la columna para el detector UV fijado para medir la absorbancia a 280 nm usando un tubo de PEEK.
4. Gradualmente aumentar la velocidad de flujo de la columna en incrementos de 0,05 a 0,1 ml / min hasta una velocidad de flujo final de 0,4 ml / min se alcanza. Mientras esto ocurre, compruebe las conexiones de la tubería a la columna que no haya fugas. Monitorear la presióndel sistema para asegurar que no supere los requisitos de columna mediante la observación de la traza de la presión en el cromatograma en el software.
5. Deja la columna equilibrar a la velocidad de flujo requerida de más de 5 - 10 volúmenes de columna. Después de que se equilibra, conectar los instrumentos que permiten el análisis de la muestra que se produzca.
6. Configurar el método de HPLC hasta la bomba tampón A sobre la columna a 0,4 ml / min durante 15 min.

4. Configuración y ejecución de exclusión por tamaños - plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas

Nota: Los procedimientos operativos pueden variar entre los instrumentos y modelos. Póngase en contacto con el técnico especialista instrumento para aprender más acerca de cómo configurar el ICP-MS está utilizando.

1. Coloque el ICP - MS en modo de espera antes de cambiar la configuración de hardware.
   1. Una vez en el modo de espera, apagar la comunicación para el muestreador automático y cambiar la introducción de la muestra al "otro".
      Nota: Dependiendo del software y duroArtículos de configuración seleccionando "HPLC" como fuente de introducción de muestras se puede utilizar. Póngase en contacto con el técnico especialista instrumento para saber si esta opción está disponible.
2. Utilice PEEK tubo (ID 0,13 mm) para conectar el flujo de salida desde el detector de UV directamente al nebulizador en la ICP-MS.
3. El poder una copia de seguridad del ICP - MS y deje que el instrumento se caliente durante 10 - 20 min.
4. Después de que el plasma ha encendido, conecte el cable alejado de la ICP - MS de la parte posterior del inyector automático HPLC. Para ello, una vez que el plasma se ha encendido; de lo contrario el sistema de HPLC se apagará automáticamente desde el ICP - MS no está encendida.
5. Cambiar el método ICP-MS para recopilar datos para LC-ICP-MS.
   1. Alterar el método de adquisición de espectro para la adquisición de tiempo de resolución (TRA).
   2. Seleccionar los elementos a analizar, Fe, Cu, Zn, Co, I, así como cualesquiera otros elementos de interés, y establecer tiempos de integración (típicamente entre 0,05 a 0,3 seg). Después de que los elementos de interés de unare elegido, ajustar el tiempo de adquisición para que coincida con el tiempo de ejecución para la cromatografía (por ejemplo, 900 segundos para una carrera de cromatografía 15 min).
   3. Sintonización manual de la ICP - MS para el helio sensibilidad y la colisión de células (He) las tasas de flujo de gas con el tampón de cromatografía que fluye usando Cs y Sb incluyen en la memoria intermedia. Las velocidades de flujo Él son típicamente ~ 1 ml / min menos que los utilizados para el análisis a granel. Una vez que los recuentos de iones metálicos se han estabilizado y valores de la desviación estándar relativa (RSD) están por debajo de 5%, el sistema está listo para usar.
6. Hacer listas de conductos de muestra tanto en la HPLC y los programas de software de ICP-MS. La lista de ejemplos de ejecución contiene el orden en que cada una de las muestras se ha de inyectar, así como el nombre con el que se guardarán los datos. Compruebe que el número total de muestras en el partido de la lista entre los dos programas.
7. Iniciar el lote de muestra de la ICP-MS antes de la HPLC, como la inyección de la muestra por el HPLC dará lugar a la ICP - MS para comenzar a recogerdatos. Si esto no se hace en el orden correcto que dará lugar a los datos que faltan.
8. Generar puntos de la curva de calibración mediante la inyección de volúmenes variables de la SOD y estándar mezclado FTN de 200 mg / l a 6.000 g / L inyecta en la columna para Cu y Zn y 2.000 mg / l hasta 60.000 mg / l para el Fe. Los volúmenes de inyección oscilan de 1 a 30 l.
   Nota: Estos intervalos de concentración abarcan las concentraciones de Fe, Cu y Zn típicamente observados en homogeneizados de complejos. Para muestras que contienen sólo proteínas purificadas el rango máximo de la curva debe ajustarse en consecuencia. A medida que la cantidad de metal asociado con la proteína puede requerir un rango más pequeño o más grande ya que hay menos contaminación en la muestra de otros factores.
9. Analizar cada uno de los cultivos de tejidos muestras desconocidas, plasma o célula.

5. Análisis de datos, manipulación y visualización

1. Almacenar los datos en el valor separados por comas (CSV) formato de archivo y cargar into programas de procesamiento según sea necesario.
2. Con el fin de controlar la deriva del instrumento, dividir las cuentas por segundo para cada elemento de las cuentas por segundo, ya sea para Cs o Sb.
3. Generar curvas de calibración para cada uno de los elementos.
   1. Determinar el área bajo el pico de metal que corresponde a la metalloprotein que está obligado a para cada una de las inyecciones mediante la realización de la integración de picos en el software de análisis de datos preferida.
   2. Trazar el área bajo el pico de metal frente a la cantidad total del metal que fue inyectado en la columna en cada ejecución, 200 - 6000 g / L de Cu y Zn y 2000 - 60.000 mg / L de Fe. Realizar un análisis de regresión lineal de acuerdo con el protocolo de software.
   3. Utilizar los resultados de pendiente a partir del análisis de regresión lineal como un factor para convertir cuentas por segundo a pg / seg. Divide cada una de las cuentas por segundo puntos de datos en todo el cromatograma por el gradiente de la línea de valor.
4. Graficar los datos enpg / seg para el tiempo cromatograma. Determinar el área bajo los picos de interés. El área bajo el pico representa la cantidad total de metal que la proteína se une a, en pg.
5. Generar una calibración basado en el peso molecular de las metaloproteínas conocida y la hora a la que se eluyen. Use esto para estimar el tamaño de los picos de proteínas en muestras complejas.

Resultados

El uso de estándares metaloproteínas permite la calibración de la columna de exclusión de tamaño. La Figura 1A muestra el perfil de elución para la normas tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD y la vitamina B ₁₂ basada en el metal que están obligados a (Fe, Co, Cu, Zn y I). la Figura 1B muestra la curva de calibración para la columna de exclusión de tamaño en base al peso molecular de los estándares de proteína y su tiempo de elución, se presenta en el formato de volumen de elución (Ve) dividido por el volumen vacío de la columna (Vo). Las proteínas usadas para generar esta curva estándar se concanavalina A, conalbúmina, ceruloplasmina, la ferritina, SOD y tiroglobulina.

La Figura 2A muestra la elución de la ferritina en un rango de 2.000 - 60.000 pg de Fe inyectada en la columna y la Figura 2D es el análisis de regresión a cabo utilizando párea EAK. Figuras 2B y 2C son los perfiles de elución de Cu / Zn SOD para Cu y Zn y 2E y 2F son los análisis de regresión generadas usando áreas de los picos. Los resultados del análisis de regresión se utilizan para convertir los datos en bruto en los recuentos / seg a pg / seg por lo que la cantidad de metal asociado con la proteína puede determinarse cuantitativamente. La conversión se realiza dividiendo la cuentas / s por la pendiente de la regresión lineal (por ejemplo, 334,6 (cuentas / segundo) x (seg / pg) de cobre).

Como se ha indicado, esta técnica se puede utilizar para identificar metaloproteínas en muestras biológicas complejas. Cerebro y plasma humano han sido sometidos a esta técnica y las figuras 3 y 4, respectivamente, muestran los resultados obtenidos. El cerebro humano separados por SEC-ICP-MS se muestra en las figuras 3A-3C, cada uno de los cuales representan un metal diferente de interés (Cu, Zn o Fe). Las figuras 4A-4C muestran las trazas obtenidas cuando el plasma humano es sometida a esta técnica. La complejidad y la abundancia de la muestra tendrán un impacto en el número de picos que se ven. Como plasma esperada está dominado por unos pocos metaloproteınas incluyendo ceruloplasmina y transferrina.

Figura 1. Calibración de cromatografía de exclusión - plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas Usando Conocido perfil metaloproteínas (A) La elución de las normas de las metaloproteinasas basadas en sus respectivos metales.. (B) curva de calibración de peso molecular para los estándares de proteína tiroglobulina (i), ferritina (ii), ceruloplasmina (iii), conalbúmina (iv), Cu / Zn SOD (v) y concanavalina A (vi)."Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Uso de ferritina y Cu / Zn SOD como Normas metalloprotein para determinar la cantidad de Cu, Fe o Zn Asociado con metaloproteínas en una muestra biológica compleja (A) Perfil de elución de ferritina sobre el rango de inyección de 2.000 -. 60.000 mg / l de hierro. (B) y el perfil de elución (C) para la Cu / Zn SOD sobre el rango de inyección de 200 - 6000 g / l de cobre y zinc, respectivamente. (D), (E) y (F) muestran los resultados del análisis de regresión para el hierro metales, cobre y zinc, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Cu, Fe y Zn Metalloproteome del cerebro humano. (A) traza de cobre (B) traza hierro (C) El zinc rastro. La elución de los patrones de proteína para cada metal se muestra mediante el trazo negro con su peso molecular se indica en el gráfico. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Cu, Fe y Zn Metalloproteome de plasma humano. (A) traza traza Hierro Cobre (B) (C) El zinc rastro. La elución de los patrones de proteína para cada metal se muestra por la traza negro con su peso molecular endicated debajo de la gráfica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Asegurar el estado nativo de la proteína significa una atención especial a los tampones y es necesario efectuar el almacenamiento de la muestra. No se pueden emplear todas las técnicas de cromatografía o técnicas de preparación de muestras. Es importante que los tampones utilizados en la preparación de muestras y la cromatografía están desprovistas de quelantes de metales y tampones de uso que imitan pH y concentraciones de sal fisiológicas. Otras condiciones a evitar incluyen el calentamiento de la muestra o la adición de agentes desnaturalizantes de proteínas (por ejemplo, urea). Es crítico para reducir al mínimo el número de ciclos de congelación y descongelación. La capacidad de la memoria intermedia elegida para unir metales divalentes también es importante y es una razón que Tris o de amonio tampones nitrato se eligen entre topes basados ​​en fosfato.

La capacidad de baja resolución y pico de la cromatografía de exclusión de tamaño en relación con otras formas de cromatografía es una limitación importante de esta técnica. Sin embargo, la naturaleza suave de tamaño chromatogra exclusiónphy es importante mantener el estado nativo de la proteína y por lo tanto preservar los enlaces metal-proteína relativamente débiles. El requisito para mantener el estado natural de las proteínas requiere especial atención al tratamiento de las muestras, incluyendo la limitación del número de ciclos de congelación y descongelación, evitando quelantes de metales (por ejemplo, EDTA) o sales y detergentes caotrópicos.

Esta baja resolución de este impactos técnica de la capacidad de cuantificar la cantidad de metal asociado con una proteína específica si se encuentra en una muestra compleja como los picos observados contendrá más de una proteína. Por lo tanto, la cantidad de metal se determina utilizando el pico de la integración sería una indicación de la cantidad total de metal asociado con todas las proteínas que eluye a este punto de tiempo y no sólo una proteína específica. Con el fin de superar esta limitación la proteína de interés tendría que purificarse adicionalmente en condiciones nativas. Esto permitiría la cuantificación deel metal asociado con esta proteína que se informó con un mayor grado de certainity. Otra limitación potencial de esta técnica sería la pérdida de proteína debido a la unión reversible no a la columna. Con el fin de determinar si esto está ocurriendo un experimento de recuperación debe ser llevado a cabo mediante el cual se analiza la cantidad de proteína de elución de la columna para determinar si este coincide con la cantidad inyectada. El mismo se puede hacer mediante la medición del contenido de metal del material de elución y el material de partida por mayor ICP-MS. La recuperación de la columna puede variar dependiendo de las condiciones usadas, pero se ha demostrado que la recuperación completa de proteínas a partir de una columna de exclusión por tamaño es posible ^9. Por lo tanto, es importante comprobar si hay o no hay ninguna pérdida en las condiciones de operación que se utiliza.

Las modificaciones en el protocolo pueden estar relacionados con las normas metaloproteínas que se utilizan, así como los elementos analizados. El tipo de norma metaloproteına nosotrosed será diferente dependiendo de los elementos que son de interés. Para los elementos tales como Cu, Fe y Zn proteínas, se emplean SOD y ferritina. Cualquier otro metalloprotein que tienen stoichometries conocidos también se pueden utilizar y algunos ejemplos se han mostrado aquí.

Una de las principales complicaciones que pueden surgir de la utilización de esta técnica es la acumulación de cristales de sal en la antorcha del ICP-MS. Para evitar la acumulación de cristales de sal, la antorcha se lava con agua destilada después de cada 500 - 1000 ml de tampón que se ha transmitido a través del sistema o cuando se determina mediante inspección visual de que el soplete se debe lavar. Otro problema que puede surgir es un descenso más rápido de la limpieza de los conos y extracción de muestras. Estos deben ser limpiados con regularidad siguiendo los protocolos del fabricante.

La preparación de la muestra inicial es el paso más crítico en el protocolo. Si hay algún cambio en la proteína - complejo de metal de la información generado no será válida. Esta es una de las principales limitaciones de la técnica; Además el uso de la baja resolución, columna de exclusión por tamaño se obtiene una vista de detalle limitado de la verdadera complejidad de metaloproteínas de la biología.

La técnica descrita aquí permite la expansión del conocimiento de la metalloproteome de un organismo. El análisis a granel sólo da una indicación aproximada de los cambios a la cantidad de metal dentro de una muestra. Además de las consideraciones generales que deben tenerse en cuenta, esta técnica proporciona una herramienta que se puede utilizar para cuantificar la cantidad de metal asociado con proteínas, así como la identificación de metaloproteínas que difieren mediante la comparación de las trazas obtenidas. El uso de esta técnica se puede emplear para identificar las diferencias entre los estados de enfermedad. Los metaloproteınas identificados a continuación, pueden investigarse más a fondo para ayudar a determinar el papel que desempeñan en los procesos de enfermedad. La aplicación de un guión ICP-MS tiene un crecimientofuturo para determinar el papel de los fármacos que tienen un heteroátomo tal como el platino, el yodo o el cobre como el ICP-MS se puede utilizar para identificar las proteínas que se une el fármaco.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 1290 Infinity Binary Pump	Agilent	G4220A
Agilent 1290 Infinity Autosampler	Agilent	G4226A
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat	Agilent	G1330B
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment	Agilent	G1316C
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector	Agilent	G1314E
Agilent 7700 ICP-MS	Agilent	G3282A
Ammonium hydroxide trace metal basis	Sigma	338818
Ammonium nitrate	Sigma	256064	Make fresh 200mM solution on day of experiment
Antinomy	Choice analytical	10002-3
Ceruloplasmin	Sigma
Cesium	Choice analytical	100011-1
Complete, EDTA free protease inhibitors	Roche	11873580001
Conalbumin	Sigma	C7786
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)	Sigma	L7647
Cu, Zn Superoxide dismutase	Sigma	S9697
Ferritin	Sigma	F4503
ICP-MS multielemental calibration standards	AccuStandard		Made up to required concentrations in 1% nitric acid
Microvolume UV spectrophotometer	Thermo Scientific
65% Nitric acid	Millipore	100441	Diluted to 1% for use
Peek tubing	Agilent	5042-6461
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å	Agilent	5190-2508
Sodium Chloride	Chem Supply	SA046
Tris Hydrochloride	ICN Biomedicals inc.	103130
Thyroglobulin	Sigma	T9145
Vitamin B12	Sigma	V2876