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Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
metales esenciales desempeñan un papel vital en las funciones biológicas normales, incluyendo las vías mensajeras secundarias, vías de metabolismo y las funciones de los orgánulos. 30% de todas las proteínas se cree que son metaloproteínas 1 y 50% de todas las enzimas 2. Metaloenzimas utilizan estos metales traza como cofactores para catalizar reacciones químicas, estabilizar la estructura de proteínas, y para las funciones de regulación, tales como mensajeros secundarios. Algunos de los elementos traza más estudiados en lo que respecta a la neurodegeneración son el cobre, el hierro y el zinc 3. Se cree que participan en muchas vías de la enfermedad, donde por dyshomeostasis puede tener efectos adversos. Por ejemplo el estado de metal de la superóxido dismutasa (SOD) directamente afecta a la duración de la vida y el fenotipo de los modelos de ratones transgénicos de tipo familiar de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) 4. En la enfermedad de Alzheimer, metalloproteomics técnicas se han utilizado para descubrir una disminución en el estado de metal de transferrina en pLasma 5. Estos estudios ponen de relieve las metaloproteínas importante papel que pueden desempeñar en la enfermedad.
El estudio de metaloproteínas directamente de los tejidos biológicos es un campo en desarrollo. Aunque algunos metaloenzimas se han caracterizado, la mayoría todavía permanecen sin caracterizar o desconocido 6. Uno de los principales retos en metaloproteínas de medición es el requisito para mantener el estado natural de la proteína 7. Classical abajo arriba técnicas proteómicas se basan en la digestión de las proteínas en péptidos. Este proceso altera la interacción no covalente de metales y sus proteínas. Por lo tanto, se obtiene ninguna información sobre el estado de metal de una proteína.
Una forma de superar este problema es mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño se combina con plasma acoplado inductivamente - 8,9 espectrometría de masas (SEC-ICP-MS). Esto genera información sobre el tamaño aproximado de la proteína, así como de todos los metales que son Associated con él 10. Además, la exclusión de tamaño es una técnica cromatográfica suave que puede preservar el estado natural de un complejo de enzima o proteína-proteína. Una de las ventajas de la utilización de plasma de acoplamiento inductivo - espectrometría de masas (ICP-MS) es la naturaleza cuantitativa de la tecnología. El uso de un conjunto de normas de metaloproteínas es posible proporcionar la cuantificación absoluta de metaloproteínas de muestras biológicas 9,11. Esto se logra mediante la generación de una curva estándar mediante la inyección de metaloproteínas conocidos en un intervalo de concentraciones de metales.
Este protocolo muestra un ejemplo de cómo esto puede lograrse por una variedad de normas de metaloproteínas. En este trabajo pretendemos crear las curvas de calibración para los metales que son investigados en gran medida en los campos biológicos, incluyendo el hierro (Fe), cobre (Cu), zinc (Zn), yodo (I) y cobalto (Co).
1. Preparación de tampones y muestras
2. Análisis de las Normas granel metalloprotein El uso de plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas
Nota: Esta sección debe realizarse de forma paralela a la anterior, ya que ambos requieren cerca de 1 - 1,5 horas para completar.
4. Configuración y ejecución de exclusión por tamaños - plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas
Nota: Los procedimientos operativos pueden variar entre los instrumentos y modelos. Póngase en contacto con el técnico especialista instrumento para aprender más acerca de cómo configurar el ICP-MS está utilizando.
5. Análisis de datos, manipulación y visualización
El uso de estándares metaloproteínas permite la calibración de la columna de exclusión de tamaño. La Figura 1A muestra el perfil de elución para la normas tiroglobulina, ferritina, ceruloplasmina, Cu / Zn SOD y la vitamina B 12 basada en el metal que están obligados a (Fe, Co, Cu, Zn y I). la Figura 1B muestra la curva de calibración para la columna de exclusión de tamaño en base al peso molecular de los estándares de proteína y su tiempo de elución, se presenta en el formato de volumen de elución (Ve) dividido por el volumen vacío de la columna (Vo). Las proteínas usadas para generar esta curva estándar se concanavalina A, conalbúmina, ceruloplasmina, la ferritina, SOD y tiroglobulina.
La Figura 2A muestra la elución de la ferritina en un rango de 2.000 - 60.000 pg de Fe inyectada en la columna y la Figura 2D es el análisis de regresión a cabo utilizando párea EAK. Figuras 2B y 2C son los perfiles de elución de Cu / Zn SOD para Cu y Zn y 2E y 2F son los análisis de regresión generadas usando áreas de los picos. Los resultados del análisis de regresión se utilizan para convertir los datos en bruto en los recuentos / seg a pg / seg por lo que la cantidad de metal asociado con la proteína puede determinarse cuantitativamente. La conversión se realiza dividiendo la cuentas / s por la pendiente de la regresión lineal (por ejemplo, 334,6 (cuentas / segundo) x (seg / pg) de cobre).
Como se ha indicado, esta técnica se puede utilizar para identificar metaloproteínas en muestras biológicas complejas. Cerebro y plasma humano han sido sometidos a esta técnica y las figuras 3 y 4, respectivamente, muestran los resultados obtenidos. El cerebro humano separados por SEC-ICP-MS se muestra en las figuras 3A-3C, cada uno de los cuales representan un metal diferente de interés (Cu, Zn o Fe). Las figuras 4A-4C muestran las trazas obtenidas cuando el plasma humano es sometida a esta técnica. La complejidad y la abundancia de la muestra tendrán un impacto en el número de picos que se ven. Como plasma esperada está dominado por unos pocos metaloproteınas incluyendo ceruloplasmina y transferrina.
Figura 1. Calibración de cromatografía de exclusión - plasma acoplado inductivamente - Espectrometría de Masas Usando Conocido perfil metaloproteínas (A) La elución de las normas de las metaloproteinasas basadas en sus respectivos metales.. (B) curva de calibración de peso molecular para los estándares de proteína tiroglobulina (i), ferritina (ii), ceruloplasmina (iii), conalbúmina (iv), Cu / Zn SOD (v) y concanavalina A (vi)."Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Uso de ferritina y Cu / Zn SOD como Normas metalloprotein para determinar la cantidad de Cu, Fe o Zn Asociado con metaloproteínas en una muestra biológica compleja (A) Perfil de elución de ferritina sobre el rango de inyección de 2.000 -. 60.000 mg / l de hierro. (B) y el perfil de elución (C) para la Cu / Zn SOD sobre el rango de inyección de 200 - 6000 g / l de cobre y zinc, respectivamente. (D), (E) y (F) muestran los resultados del análisis de regresión para el hierro metales, cobre y zinc, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Cu, Fe y Zn Metalloproteome del cerebro humano. (A) traza de cobre (B) traza hierro (C) El zinc rastro. La elución de los patrones de proteína para cada metal se muestra mediante el trazo negro con su peso molecular se indica en el gráfico. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cu, Fe y Zn Metalloproteome de plasma humano. (A) traza traza Hierro Cobre (B) (C) El zinc rastro. La elución de los patrones de proteína para cada metal se muestra por la traza negro con su peso molecular endicated debajo de la gráfica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Asegurar el estado nativo de la proteína significa una atención especial a los tampones y es necesario efectuar el almacenamiento de la muestra. No se pueden emplear todas las técnicas de cromatografía o técnicas de preparación de muestras. Es importante que los tampones utilizados en la preparación de muestras y la cromatografía están desprovistas de quelantes de metales y tampones de uso que imitan pH y concentraciones de sal fisiológicas. Otras condiciones a evitar incluyen el calentamiento de la muestra o la adición de agentes desnaturalizantes de proteínas (por ejemplo, urea). Es crítico para reducir al mínimo el número de ciclos de congelación y descongelación. La capacidad de la memoria intermedia elegida para unir metales divalentes también es importante y es una razón que Tris o de amonio tampones nitrato se eligen entre topes basados en fosfato.
La capacidad de baja resolución y pico de la cromatografía de exclusión de tamaño en relación con otras formas de cromatografía es una limitación importante de esta técnica. Sin embargo, la naturaleza suave de tamaño chromatogra exclusiónphy es importante mantener el estado nativo de la proteína y por lo tanto preservar los enlaces metal-proteína relativamente débiles. El requisito para mantener el estado natural de las proteínas requiere especial atención al tratamiento de las muestras, incluyendo la limitación del número de ciclos de congelación y descongelación, evitando quelantes de metales (por ejemplo, EDTA) o sales y detergentes caotrópicos.
Esta baja resolución de este impactos técnica de la capacidad de cuantificar la cantidad de metal asociado con una proteína específica si se encuentra en una muestra compleja como los picos observados contendrá más de una proteína. Por lo tanto, la cantidad de metal se determina utilizando el pico de la integración sería una indicación de la cantidad total de metal asociado con todas las proteínas que eluye a este punto de tiempo y no sólo una proteína específica. Con el fin de superar esta limitación la proteína de interés tendría que purificarse adicionalmente en condiciones nativas. Esto permitiría la cuantificación deel metal asociado con esta proteína que se informó con un mayor grado de certainity. Otra limitación potencial de esta técnica sería la pérdida de proteína debido a la unión reversible no a la columna. Con el fin de determinar si esto está ocurriendo un experimento de recuperación debe ser llevado a cabo mediante el cual se analiza la cantidad de proteína de elución de la columna para determinar si este coincide con la cantidad inyectada. El mismo se puede hacer mediante la medición del contenido de metal del material de elución y el material de partida por mayor ICP-MS. La recuperación de la columna puede variar dependiendo de las condiciones usadas, pero se ha demostrado que la recuperación completa de proteínas a partir de una columna de exclusión por tamaño es posible 9. Por lo tanto, es importante comprobar si hay o no hay ninguna pérdida en las condiciones de operación que se utiliza.
Las modificaciones en el protocolo pueden estar relacionados con las normas metaloproteínas que se utilizan, así como los elementos analizados. El tipo de norma metaloproteına nosotrosed será diferente dependiendo de los elementos que son de interés. Para los elementos tales como Cu, Fe y Zn proteínas, se emplean SOD y ferritina. Cualquier otro metalloprotein que tienen stoichometries conocidos también se pueden utilizar y algunos ejemplos se han mostrado aquí.
Una de las principales complicaciones que pueden surgir de la utilización de esta técnica es la acumulación de cristales de sal en la antorcha del ICP-MS. Para evitar la acumulación de cristales de sal, la antorcha se lava con agua destilada después de cada 500 - 1000 ml de tampón que se ha transmitido a través del sistema o cuando se determina mediante inspección visual de que el soplete se debe lavar. Otro problema que puede surgir es un descenso más rápido de la limpieza de los conos y extracción de muestras. Estos deben ser limpiados con regularidad siguiendo los protocolos del fabricante.
La preparación de la muestra inicial es el paso más crítico en el protocolo. Si hay algún cambio en la proteína - complejo de metal de la información generado no será válida. Esta es una de las principales limitaciones de la técnica; Además el uso de la baja resolución, columna de exclusión por tamaño se obtiene una vista de detalle limitado de la verdadera complejidad de metaloproteínas de la biología.
La técnica descrita aquí permite la expansión del conocimiento de la metalloproteome de un organismo. El análisis a granel sólo da una indicación aproximada de los cambios a la cantidad de metal dentro de una muestra. Además de las consideraciones generales que deben tenerse en cuenta, esta técnica proporciona una herramienta que se puede utilizar para cuantificar la cantidad de metal asociado con proteínas, así como la identificación de metaloproteínas que difieren mediante la comparación de las trazas obtenidas. El uso de esta técnica se puede emplear para identificar las diferencias entre los estados de enfermedad. Los metaloproteınas identificados a continuación, pueden investigarse más a fondo para ayudar a determinar el papel que desempeñan en los procesos de enfermedad. La aplicación de un guión ICP-MS tiene un crecimientofuturo para determinar el papel de los fármacos que tienen un heteroátomo tal como el platino, el yodo o el cobre como el ICP-MS se puede utilizar para identificar las proteínas que se une el fármaco.
The authors have nothing to disclose
Nos gustaría reconocer el apoyo del Programa de Gobierno de Victoria Operacional Apoyo a la Infraestructura, el proyectos de vinculación Esquema Consejo de Investigación Australiano (con Agilent Technologies), el Centro de Investigación Cooperativa del Consejo de Investigación Médica, el banco de cerebros de estilo victoriano, Nacional de Salud y de Australia para la Salud Mental y el Neuroproteomics instalaciones.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |
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