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Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
Wesentliche Metalle spielen eine entscheidende Rolle bei der normalen biologischen Funktionen, einschließlich der sekundären Botenwege, Stoffwechselwege und Organell Funktionen. 30% aller Proteine sind gedacht , Metalloproteine 1 und 50% aller Enzyme 2 sein. Metalloenzyme nutzen diese Spurenmetalle als Cofaktoren chemische Reaktionen zu katalysieren, Proteinstruktur und für regulatorische Funktionen wie sekundäre Botenstoffe stabilisieren. Einige der untersuchten Spurenelemente in Bezug auf die Neurodegeneration sind Kupfer, Eisen und Zink - 3. Sie sind gedacht, in vielen Krankheitswegen beteiligt werden, in denen durch dyshomeostasis haben negative Auswirkungen. Beispielsweise die Metallstatus von Superoxid - Dismutase (SOD) wirkt sich direkt auf die Lebensdauer und Phänotyp der transgenen Mausmodellen von familiärer Art von amyotropher Lateralsklerose (ALS) 4. Bei der Alzheimer-Krankheit, wurden metalloproteomics Techniken verwendet, um eine Abnahme in der Metallstand von Transferrin in p zu entdecken5 LASMA. Diese Studien unterstreichen die wichtige Rolle Metalloproteine in Krankheit spielen kann.
Die Studie von Metalloproteinen direkt aus biologischen Geweben ist ein Entwicklungsfeld. Obwohl einige Metalloenzyme charakterisiert worden sind, bleiben die meisten immer noch nicht charakterisierten oder unbekannt 6. Eine der großen Herausforderungen bei der Messung Metalloproteine ist die Forderung , den nativen Zustand des Proteins 7 zu halten. Klassische Bottom-up-Proteom-Techniken stützen sich auf die Verdauung der Proteine in Peptide. Dieser Vorgang unterbricht die nichtkovalente Interaktion von Metallen und deren Proteine. Somit wird keine Information über das Metall Status eines Proteins gewonnen.
Eine Möglichkeit , dieses Problem zu überwinden , ist die Verwendung von Grßenausschlußchromatographie mit induktiv gekoppeltem Plasma gepaart - Massenspektrometrie 8,9 (SEC-ICP-MS). Dies erzeugt Informationen über die ungefähre Größe des Proteins sowie alle Metalle, die Assoc sindverbundes mit ihm 10. Ferner ist Größenausschluss eine sanfte chromatographische Technik, die den nativen Zustand eines Enzyms oder Protein-Protein-Komplex erhalten kann. Ein Vorteil induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) ist die quantitative Natur der Technologie. Mit einer Reihe von Metalloproteinen Standards ist es möglich , absolute Quantifizierung von Metalloproteine aus biologischen Proben 9,11 bereitzustellen. Dies wird durch Erzeugen einer Standardkurve durch Injizieren bekannter Metalloproteine über einen Bereich von Metallkonzentrationen erreicht.
Dieses Protokoll zeigt ein Beispiel, wie dies für eine Vielzahl von Metalloprotein Standards erreicht werden. In diesem Papier wollen wir Standardkurven für Metalle zu schaffen, die in biologischen Gebieten, einschließlich Eisen weitgehend untersucht (Fe), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Jod (I) und Cobalt (Co).
1. Herstellung von Puffern und Proben
2. Massenanalyse von Metalloprotein Standards mit induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie
Anmerkung: Dieser Abschnitt sollte parallel zum vorhergehenden durchgeführt werden, da sie beide etwa 1 erforderlich - 1,5 Stunden durchzuführen.
4. Einrichten und Größenausschluss Running - Induktiv gekoppeltes Plasma - Massenspektrometrie
Hinweis: Betriebsverfahren kann variieren zwischen den Instrumenten und Modellen. Kontaktieren Sie das Instrument technischer Spezialist mehr darüber zu erfahren, wie die ICP-MS verwendet zu konfigurieren ist.
5. Datenanalyse, Manipulation und Visualisierung
Die Verwendung von Metalloprotein Standards ermöglicht die Kalibrierung der Grßenausschlußsäule. 1A zeigt das Elutionsprofil für die Standards Thyroglobulin, Ferritin, Ceruloplasmin, Cu / Zn - SOD und Vitamin B 12 , bezogen auf das Metall , das sie gebunden sind (Fe, Co, Cu, Zn und I). 1B zeigt die Eichkurve für die Spalte Grßenausschluß basierend auf dem Molekulargewicht der Proteinstandards und deren Elutionszeit, in dem Format von Elutionsvolumen dargestellt (Ve) , geteilt durch das Leervolumen der Säule (Vo). Die Proteine verwendet, um dieses Standardkurve zu erzeugen, sind Concanavalin A, Conalbumin, Ceruloplasmin, Ferritin, SOD und Thyreoglobulin.
2A zeigt die Elution von Ferritin über einen Bereich von 2.000 - 60.000 pg Fe injiziert auf Spalten- und 2D ist die Regressionsanalyse durchgeführt unter Verwendung von peak Bereich. 2B und 2C sind die Elutionsprofile für Cu / Zn SOD für Cu und Zn und 2E und 2F sind die Regressionsanalyse unter Verwendung von Peakflächen erzeugt. Die Ergebnisse der Regressionsanalyse verwendet, um die Rohdaten in Counts / sec zu pg / sec zu konvertieren, so dass die Menge an Metall, die mit dem Protein assoziiert ist, quantitativ bestimmt werden. Die Umwandlung wird durch Division des Counts / sec durch die Steigung der linearen Regression durchgeführt (zB 334,6 (Counts / s) x (s / pg) Kupfer).
Wie bereits erwähnt, kann diese Technik verwendet werden, Metalloproteine in komplexen biologischen Proben zu identifizieren. Menschliche Gehirn und Plasma wurden zu dieser Technik unterzogen und Figuren 3 bzw. 4 erhaltenen Ergebnisse zeigen. Menschliche Gehirn getrennt durch SEC-ICP-MS ist in den 3A bis 3C gezeigt, von denen jede repräsentieren eine andere Metall der Interesse (Cu, Zn oder Fe). 4A-4C die Spuren erhalten zeigen , wenn Humanplasma dieser Technik unterzogen wird. Die Komplexität und die Fülle der Probe wird die Anzahl der Spitzen auswirken, die zu sehen sind. Wie erwartet Plasma wird durch ein paar Metalloproteine einschließlich Ceruloplasmin und Transferrin bestimmt.
Abbildung 1. Kalibrierung der Größe Chromatographie Ausschluss - Massenspektrometrie unter Verwendung bekannter Metalloproteins (A) Elutionsprofil für die Metalloprotein Standards auf der Grundlage ihrer jeweiligen Metalle - Induktiv Plasma gekoppelt ist .. (B) Molekulargewichtskalibrierungskurve für Proteinstandards Thyroglobulin (i), Ferritin (ii), Ceruloplasmin (iii), Conalbumin (iv), Cu / Zn - SOD (v) und Concanavalin A (vi)."Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Verwendung von Ferritin und Cu / Zn - SOD als Metalloprotein Standards zur Bestimmung der Menge an Cu, Fe oder Zn Verbunden mit Metalloproteins in einer komplexen biologischen Probe (A) Elutionsprofil für Ferritin über den Injektionsbereich 2000 -. 60.000 ug / l Eisen. (B) und (C) Elutionsprofil für Cu / Zn SOD auf die Injektionsbereich von 200 - 6000 g / L von Kupfer und Zink, respectively. (D), (E) und (F) zeigen die Regressionsanalyseergebnissen für die Metalle Eisen, Kupfer und Zink sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Cu, Fe und Zn Metalloproteome des menschlichen Gehirns. (A) Kupferspur (B) Eisen Spur (C) Zink Spur. Die Elution der Proteinstandards für jedes Metall durch die schwarze Kurve mit ihrem Molekulargewicht unter dem Diagramm angezeigt dargestellt ist. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Cu, Fe und Zn Metalloproteome für Humanplasma. (A) Kupferspur (B) Eisen Spur (C) Zink Spur. Die Elution der Proteinstandards für jedes Metall wird durch die schwarze Kurve mit ihrem Molekulargewicht gezeigt indicated unter dem Graphen. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Gewährleistung der nativen Zustand des Proteins bedeutet, besondere Aufmerksamkeit auf die Puffer verwendet und Lagerung der Probe erforderlich sind. Nicht alle chromatographischen Techniken oder Probenpräparationstechniken können eingesetzt werden. Es ist wichtig, dass die Puffer im gesamten Probenvorbereitung und Chromatographie verwendet frei sind von Metallchelatoren und Puffer, die Verwendung physiologischen pH-Wert und Salzkonzentrationen nachahmen. Andere Bedingungen zu vermeiden , umfassen Erwärmen der Probe oder die Zugabe von Proteindenaturierungsmitteln (zB Harnstoff). Es ist wichtig, die Anzahl der Gefrier-Auftau-Zyklen zu minimieren. Die Fähigkeit des gewählten Puffers zweiwertiger Metalle zu binden, ist ebenfalls wichtig und ist ein Grund dafür, daß Tris oder Ammoniumnitrat Puffer über Phosphatbasis Puffern ausgewählt werden.
Die niedrige Auflösung und Peakkapazität der Grßenausschlußchromatographie relativ zu anderen Formen der Chromatographie ist eine wichtige Einschränkung dieser Technik. Doch die sanfte Art der Größenausschluss chromatography ist wichtig, den nativen Zustand des Proteins aufrecht zu erhalten und damit die relativ schwache Metall-Protein-Bindungen zu erhalten. Die Anforderung , den nativen Zustand der Proteine erfordert besondere Aufmerksamkeit auf die Behandlung der Proben zu erhalten , einschließlich der Anzahl der Gefrier - Auftau - Zyklen zu begrenzen, die Vermeidung Metallchelatbildner (zB EDTA) oder chaotropen Salzen und Detergenzien.
Diese geringe Auflösung dieser Technik wirkt sich auf die Fähigkeit, die Menge an Metall mit einem bestimmten Protein zu quantifizieren, wenn sie in einer komplexen Probe wie die Peaks wird mehr als ein Protein angesehen enthalten. Daher bestimmt die Menge an Metall, um die Peak-Integration unter Verwendung wäre ein Hinweis auf die Gesamtmenge an Metall zu diesem Zeitpunkt und nicht nur ein spezifisches Protein mit allen der Proteine eluierenden Verbindung gebracht werden. Um diese Einschränkung zu überwinden würde das Protein von Interesse müssen weiter unter nativen Bedingungen gereinigt werden. Dies würde für die Quantifizierung vondas Metall mit diesem Protein in Verbindung mit einem höheren Grad an certainity gemeldet werden. Eine weitere potentielle Einschränkung dieser Technik würde der Verlust an Protein aufgrund nicht reversible Bindung an die Säule. Um festzustellen, ob dies ein Rückgewinnungsexperiment geschieht sollte durchgeführt werden, wobei die Menge an Protein aus der Säule eluiert wird analysiert, um zu bestimmen, ob dies die Menge übereinstimmt injiziert. Das gleiche kann durch Messung des Metallgehalts des Eluierung Materials und des Ausgangsmaterials durch bulk ICP-MS durchgeführt werden. Spaltenrückgewinnung kann in Abhängigkeit von den verwendeten Bedingungen unterscheiden, aber es hat sich gezeigt , daß eine vollständige Rückgewinnung von Proteinen aus einer Größenausschlusssäule ist möglich 9. Daher ist es wichtig, ob oder nicht zu überprüfen ist der Verlust unter den Betriebsbedingungen verwendet werden.
Modifikationen des Protokolls können auf die Metalloprotein Standards in Beziehung gesetzt werden, die ebenso wie die untersuchten Elemente verwendet werden. Die Art der Metalloprotein Standard unsed wird in Abhängigkeit von den Elementen unterscheiden, die von Interesse sind. Für Elemente, wie Cu, Fe und Zn-Proteine, SOD und Ferritin verwendet. Jede andere Metalloprotein, die bekannt stoichometries haben, können auch verwendet werden und einige Beispiele wurden hier gezeigt.
Eine Hauptkomplikation, die diese Technik verwenden, ist der Aufbau der Salzkristalle in dem Brenner der ICP-MS entstehen können. 1,000 ml Puffer, der durch das System geleitet wurde, oder wenn es durch visuelle Inspektion festgestellt wird, daß das Brenner gewaschen werden soll - zum Aufbau der Salzkristalle zu verhindern, wird der Brenner mit destilliertem Wasser nach 500 gewaschen. Ein weiteres Problem, das ist ein schneller Rückgang der Sauberkeit der Proben- und Extraktionskegel entstehen können. Diese müssen gereinigt werden regelmäßig folgende Herstellerprotokolle.
Die anfängliche Probenvorbereitung ist der wichtigste Schritt im Protokoll. Wenn es irgendwelche Änderungen an der Protein - Metallkomplex der informationen erzeugt wird, nicht gültig ist. Dies ist eine der wichtigsten Beschränkungen der Technik; Zusätzlich ergibt die Verwendung der niedrigen Auflösung, Grßenausschlusssäule eine begrenzte detaillierte Ansicht der wahren Komplexität der Metalloproteine in der Biologie.
Die hier beschriebene Technik ermöglicht die Erweiterung des Wissens des metalloproteome eines Organismus. Massenanalyse liefert nur eine grobe Angabe der Änderungen der Menge an Metall in einer Probe. Neben den allgemeinen Überlegungen, die ergriffen werden müssen, bietet diese Technik ein Werkzeug, das verwendet werden kann, die Menge an Metall mit Proteinen sowie die Identifizierung Metalloproteine assoziiert zu quantifizieren, die durch einen Vergleich der Spuren berechnet wurde, abweichen. Die Verwendung dieser Technik kann verwendet werden, Unterschiede zwischen Krankheitszuständen zu identifizieren. Die identifizierten Metalloproteine können dann die Rolle bestimmen zu helfen, untersucht werden sie in Krankheitsprozessen spielen. Die Anwendung von Bindestrichen ICP-MS hat eine wachsendeZukunft die Rolle von Drogen zu bestimmen, die ein Heteroatom wie beispielsweise Platin, Iod oder Kupfer als ICP-MS haben, können verwendet werden, um die Proteine zu identifizieren, die das Medikament bindet.
The authors have nothing to disclose
Wir möchten Unterstützung von Operational Support der Infrastruktur-Programm der Regierung von Victoria zu bestätigen, das Australian Research Council Linkage Projekte Scheme (mit Agilent Technologies), der Australian National Health und Medical Research Council, das viktorianische Hirnbank, Cooperative Research Centre for Mental Health und der Neuroproteomics Einrichtung.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |
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