在小鼠气管插管快速的改进方法

摘要

本文介绍了通过插管直接施用博莱到小鼠气管一种快速，简便的方法。这种方法的主要优点是，它是高度可再现的，容易掌握，并且不需要专门的设备或冗长的恢复时间。

摘要

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

引言

尽管某些解剖和生理差异^，1鼠模型继续是无价建模人类生物学和疾病的发病机制^。2从饲养的角度来看，小鼠是容易处理，具有低的繁殖时间，加速寿命，并且是相对便宜的去家。用不同遗传品系和策略（例如，条件敲奏，记者小鼠谱系追踪方法等），以及在宽范围内可用的试剂（例如，抗体，重组蛋白，抑制剂的开发，等），老鼠已经成为一个重要的脊椎动物模型生物体揭示人类的稳态和疾病过程^。3

小鼠已经特别有价值用于研究肺部疾病，包括急性肺损伤（ALI）和肺纤维化^。4 ALI在人类可以通过创伤，损伤或败血症引起，其特征是上皮和内皮泄漏（即，水肿），炎症，和新生的纤维化。在许多患者中，急性肺损伤前进到它的严重的形式，急性呼吸窘迫综合征（ARDS），这经常导致纤维化和死亡因呼吸衰竭^。5,6-肺纤维化是一个渐进的，致命的病理学特征在于细胞外基质的过量沉积，最显着的I型胶原，导致肺功能受损^。-7,8-管理博莱霉素（BLM）是最广泛使用和最佳表征模型实验动物诱导ALI和纤维化^。9虽然博莱霉素诱导的肺纤维化啮齿动物确实不概括完全人类纤维化表型，与该模型¹⁰小鼠研究已导致的影响的发生和疾病的进展许多重要因素的发现^。11

虽然确切机制（S）的后面博莱霉素诱导的纤维化是未知的，则发起伤被认为是从在上皮细胞接触依赖性的DNA链断裂衬传导气道和肺泡，并且特别地，1型肺泡产生^。12的必要性BLM和肺上皮之间的直接接触突出一个健壮的递送途径的重要性和这些问题也有密切关系广泛的治疗靶向远端气道，包括重组蛋白，抗体，siRNA的，病毒，细菌，微粒，等等。口咽抽吸（OPA）已被广泛地用于此目的^13，但OPA的一个主要缺点是，递送剂的某些部分可以被吞咽到胃肠道，从而导致不精确的给药剂量。另一广泛使用的方法是经气管滴注，涉及强麻醉下气管到代理的气管和滴注暴露直接进入呼吸道^。14然而，不仅可以这样一个过程是不希望的，由于它的invasivity，但它也是耗时的，需要的培训公平位，同时产生强效伤到呼吸道^15,16若干协议已被开发涉及的试剂的直接施用进而不需要手术干预气管，引起强大麻醉药^{16,17,18,19,20-}但这些方法包括延长的恢复时间，使用昂贵的设备（即，耳镜/喉镜，市售程序板，光纤线等），在口腔中的过量操纵，和不确定性有关的剂量。

本文描述的给药通过插管相对容易的方法，其允许研究者快速，廉价和可靠地灌输试剂进鼠肺与对周围组织的残余破坏的风险有限。

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研究方案

机构的动物护理和使用委员会（IACUC）在华盛顿和雪松 - 西奈医学中心大学的必要批准这些研究动物的工作。

1.准备

1. 既消毒钝端钳和降压通过高压灭菌。
2. 使用生物安全柜，从冻干粉末制备BLM的工作原液在PBS中。超声处理10分钟，该溶液在35千赫到保证均匀混合。
   注:建议的30和45微升之间的总体积，以防止与较大体积在低端移液变异，和窒息。
3. 准备一个干净的工作区，其包括用于该过程本身约¹米2，以及两个前和后的程序笼指定地点。
4. 通过在底座和underl铺设2或3条实验室胶带固定的程序董事会立即在研究者面前的板凳基地颖替补。 图 1所示为创造一个板进一步规范。
5. 领带的过程板的两个定位螺丝之间尺寸4.0缝合线的单根长度。
6. 产生通过拆卸和从三个1毫升注射器丢弃柱塞，以及沉积60微升PBS中到每个筒的顶部上以形成气密密封的一个临时的肺活量计。固定导管的枢纽松散到注射器之一，它放置在电路板的一侧。
7. 吸300微升空气进入1毫升的注射器，并将其放置在电路板的一侧。
8. 切割胶带在长度和地点约6英寸的附加片一侧。这将被用于动物固定在板步骤2.4。
9. 设置一个异氟醚室。附加_O 2，异氟醚，真空到相应的端口上都曝光室和真空间隙。另外，施用麻醉剂在异氟醚兼容的生物安全柜。

2.插管

1. 麻醉异氟烷鼠标在室内，直到它失去意识，呼吸减慢，以适当的速度。典型的曝光包括3至4分钟的4％的异氟醚和_2％O 2，和理想的结果是2〜2.5分钟的镇静。这对应于1呼吸每2秒的呼吸速率。
2. 在等待镇静设置在，吸BLM的30和45微升之间成移液器和地点到一侧。
3. 当准备好后，从连接于程序平台的定位螺钉的螺纹暂停其上门牙的镇静鼠标。确保动物的背部靠在台表面平坦。
4. 小心不要限制通风，放置一块胶布松散整个胸腔下部（尾）部分，只是隔膜上方。位置应足够紧PROC过程中保持正确对准edure，但不是那么紧，它限制呼吸。
5. 打开照明灯％和100％的强度80之间和定向鹅颈，以便它是从皮肤的表面1至2厘米，靠近太阳穴。定期检查鹅颈管的尖端热，以确保它不伤害老鼠。
6. 站在平台背后，用无菌，钝端钳定位舌头。小心，以避免下切牙，轻轻夹住并绘制舌头口腔。
7. 使用剩余的手，插入抑制剂并用它来压平舌针对口腔的楼层。松开钳，但留下的降压到位接下来的两个步骤。
8. 定向光使气管是由从太阳穴的水平向近侧引导鹅颈管，直到它到达主支气管的水平可见的。
   注意:气管可通过呼吸的作用而容易地分开，WHICH导致发出的光的强度波动。当正确定位时，该结构将在轴向平面内的光的一个位于中心的销与在口腔中本身最小环境光可辨别。
9. 角的注射器，使得它跟随气管的自然路径，并降低22-G的导管末端，与含有微滴，直入管腔所附注射器。 PBS的泡沫将开始上升，并在成功安置每次呼吸下降。
   注意:此动作可通过几秒钟作为深度镇静的结果被延迟。
10. 喂导管在额外的5毫米。取出压舌板。
11. 移注射器相反的手，抓住中心，轻轻取下注射器。
12. BLM的30和45微升之间存到导管毂的内部的中心，连接第二注射器和分配300μl的空气进入中心。
13. 更换第二与第一含PBS的气泡注射器。泡沫将继续上升，如果程序已经成功地进行下降。

3.后护理程序

1. 取下导管和胶带，然后将动物在干燥温暖的地方，直到它恢复意识 - 通常在一两分钟。

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结果

如别处所述²¹插管小鼠每天监测体重减轻和窘迫，处死4,10或17天后通过2.5％2,2,2- 三溴腹腔注射。 支气管肺泡灌洗 （BAL）收集在PBS中洗涤三次和右肺固定在10％福尔马林，石蜡包埋，并用Masson三色由华盛顿组织学和成像核心^22的大学染色。

在既定的数据一致，博莱霉素处理的小鼠经历7和10天暴露后<...

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讨论

在雾化是不切实际由于有限的试剂可用性，安全性或成本的情况下，直接气管施用是用于递送外源剂的进入肺部优良的方法¹⁶经气管滴注已被广泛用于完成此。然而，与所有的外科手术，它也与它携带用于引起该过程本身并发症的可能性，并且不一定剂被灌输^。13 由于这些原因，已经变得越来越普遍，直接经由插管^{16,17,18,19,20-}服用一种物质进入气管。然而，?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2 ml Pipettor and Filter Tips
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board			See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment		http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101