Усовершенствованный метод Rapid интубации трахеи у мышей

Резюме

Данная статья представляет собой быстрый и простой способ введения блеомицин непосредственно в трахею мыши с помощью интубации. Основные преимущества этого метода является то, что это очень воспроизводимые, легко освоить, и не требует специального оборудования или длительных сроков восстановления.

Аннотация

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

Введение

Несмотря на некоторые анатомо-физиологические различия, ¹ модели мышиных оставаться бесценным для моделирования биологии человека и патогенеза заболевания. ² С животноводства точки зрения, мышей легки в обращении, имеют низкое время размножения, ускоренный срок, и относительно недороги в дом. С развитием различных генетических штаммов и стратегий (например., Условные нокауты, корреспондент мышей, клона трассировки подходов и т.д.), а также широкий диапазон доступных реагентов (например., Антитела, рекомбинантные белки, ингибиторы, и т.д.), мышей стали неотъемлемой модель позвоночных организм раскрыть гомеостаза и болезненных процессов человека. ³

Мыши были особенно ценны для изучения легочных заболеваний, в том числе острого повреждения легких (ALI) и фиброза легких. ⁴ ALI у человека может быть вызвана травмой, травмы или сепсиса и характеризуется эпителиальной иэндотелиальных утечки (т.е.., отек), воспаление и фиброз возникающий. У многих пациентов, ALI прогрессирует до тяжелой форме, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), что часто приводит к фиброзу и смерти из-за дыхательной недостаточности. ^5,6 Пневмосклероз является прогрессивным, фатальным патология характеризуется избыточным отложением внеклеточного матрикса , особенно типа коллагена, что приводит к нарушению функции легких. ^7,8 администрацию блеомицин (BLM) является наиболее широко используемым и наиболее хорошо охарактеризованных модель для индукции ALI и фиброз у подопытных животных. ⁹ Хотя BLM-индуцированной легочный фиброз у грызунов делает не повторять полностью на фиброзные фенотипы человека, ¹⁰ исследований на мышах с этой моделью привели к открытию многих важных факторов, влияющих на возникновение и прогрессирование болезни. ¹¹

Хотя точный механизм (ы) позади BLM-индуцированной фиброгенеза неизвестны, инициирующий травмыСчитается, что возникают из контакт-зависимые перерывов нитей ДНК в эпителиальных клетках, выстилающих проводящие дыхательные пути и альвеолы ​​и, в частности, тип 1 пневмоцитами. ¹² Необходимость прямого контакта между BLM и легочный эпителий подчеркивает важность надежной маршруту доставки , и эти проблемы также уместны в широком диапазоне процедур адресованный дистальных дыхательных путей, в том числе рекомбинантных белков, антител, миРНК, вирус, бактерии, частицы, и больше. Орофарингеального аспирации (ОРА) широко используются для этой цели ^13, но основным недостатком ОРА является то, что часть поставленного агента может быть проглочена в желудочно-кишечном тракте, тем самым приводя к неточности в введенной дозы. Другой широко применяемый подход транстрахеальная закапывания, который включает в себя трахеостомии под сильным наркозом подвергать трахеи и инстилляцию агента непосредственно в дыхательные пути. ¹⁴ Тем не менее, не только может, напримерпроцедура нежелательно из-за его invasivity, но это также много времени, требует справедливый бит обучения, и вызывает мощную травмы дыхательных путей были разработаны. ^15,16 Несколько протоколов, которые связаны с непосредственным управлением агентов в трахеи без необходимости хирургического вмешательства, ^{16,17,18,19,20,} но эти способы включают расширенные сроки восстановления вызвано мощными анестетиками, использование дорогостоящего оборудования (т.е.., отоскоп / ларингоскопическая, коммерчески доступные процедура доски, волоконно-оптические провода и т.д.), избыток манипуляции в полости рта, а также неопределенность в отношении дозировки.

Эта статья описывает относительно простой метод введения через интубации, который позволяет исследователю быстро, недорого и надежно привить реагента в мышиной легкого с ограниченным риском остаточного повреждения окружающих тканей.

протокол

Животное уходу и использованию Институциональные комитеты (IACUC) из Университета штата Вашингтон и Cedars-Sinai Medical Center одобрили животных работу, необходимую для этих исследований.

1. Подготовка

1. Стерилизовать обе тупым концом щипцов и депрессорные через автоклав.
2. Использование биологической безопасности, подготовить рабочий запас BLM в PBS с лиофилизированного порошка. Разрушать ультразвуком решение в течение 10 мин при 35 кГц, чтобы обеспечить равномерное смешивание.
   Примечание: Общий объем от 30 до 45 мкл рекомендуется для предотвращения изменения пипетки на нижнем конце, и удушье с большими объемами.
3. Подготовьте чистую рабочую среду, которая включает в себя около 1 ^{м 2 для} самой процедуры, а также отведенных мест для клеток до и после процедуры.
4. Закрепить основание процедуры борту к скамейке сразу перед исследователем путем укладки 2 или 3 полоски лабораторного ленты через основание и underlин скамейки. На рисунке 1 дальнейших уточнений по созданию доска.
5. Свяжите одну длину размер 4.0 шовная нить между двумя позиционирования винтов процедуры борту.
6. Генерировать самодельный спирометра путем удаления и отбрасывая поршень из трех 1 мл шприцы, и осаждение 60 мкл PBS в верхней части каждого ствола, чтобы сформировать герметичное уплотнение. Зафиксировать ступицу катетера неплотно к одному из шприцов и поместить его в одну сторону доски.
7. Аспирируйте 300 мкл воздуха в 1 мл шприц и поместите его в одну сторону доски.
8. Вырезать дополнительный кусок ленты около 6 дюймов в длину и отложить в сторону. Эта информация будет использоваться для обеспечения животное к доске на этапе 2.4.
9. Настройка ИФ камеру. Приложить _{О 2,} изофлуран и вакуум к соответствующим портам на обоих экспозиционной камере и вакуума зазором. В качестве альтернативы, управлять анестетик в ИФ-совместимый биологическаяБезопасность шкафа.

2. интубации

1. Обезболить мышь с изофлуран в камере, пока он не теряет сознание и дыхание замедляется до соответствующей скоростью. Типичная экспозиция включает в себя 4% изофлуран и 2% O ₂ от 3 ​​до 4 мин, а идеальный результат составляет от 2 до 2,5 мин седации. Это соответствует частоте дыхания 1 вдох каждые 2 сек.
2. В ожидании седации, чтобы привести в, аспирация от 30 до 45 мкл BLM в пипетки и отложить в сторону.
3. Когда все будет готово, приостановить седативные мышь по его верхних резцов с резьбы, прикрепленной к позиционирующих винтов процедуры платформы. Убедитесь, что спинки животного лежит вплотную прилегает к поверхности платформы.
4. Соблюдая осторожность, чтобы не ограничивать вентиляцию, поместите кусок ленты свободно поперек нижней (хвостовой) части грудной полости, чуть выше диафрагмы. Размещение должно быть достаточно жесткой, чтобы поддерживать надлежащее выравнивание во время прокаedure, но не настолько плотно, что он ограничивает дыхание.
5. Включите осветитель, чтобы между 80% и 100% интенсивности и ориентировать на шток так, чтобы он составляет от 1 до 2 см от поверхности кожи, около солнечного сплетения. Периодически проверяйте наконечник гузнеке за тепло для того, чтобы она не травмировать мышь.
6. Стоя позади платформы, использовать стерильные тупым концом щипцов, чтобы найти язык. Соблюдая осторожность, чтобы избежать нижних резцов, мягко сцепление и сделать язык из полости рта.
7. Используя оставшуюся руку, вставьте Депрессор и использовать его, чтобы сгладить язык к полу полости рта. Отпустите щипцы, но оставить Депрессор на месте в течение следующих двух шагах.
8. Направление освещения таким образом, чтобы трахеи видна, направляя на шток проксимально от уровня солнечного сплетения, пока не достигнет уровня mainstem бронхов.
   Примечание: трахеи можно легко отличить под действием дыхания, беч вызывает испускаемый свет будет колебаться в интенсивности. При правильном положении, эта структура будет заметной в осевой плоскости в качестве центрально расположенным штифтом света с минимальным окружающим светом в самой ротовой полости.
9. Угол шприц так, чтобы она вытекает естественный путь трахеи, и понизить наконечник катетера 22-G, с присоединенным шприцем, содержащим каплю, прямо в просвет. Пузырь PBS начнет подниматься и опускаться с каждым вдохом после успешного размещения.
   Примечание: Это действие может быть отложено на несколько секунд в результате глубокой седации.
10. Поток катетер в дополнительных 5 мм. Удалить язык депрессорных.
11. Сдвиг шприц в противоположную стороны, и захватывающий ступицу, аккуратно удалите шприц.
12. Депозит от 30 до 45 мкл BLM в центре внутренней части втулки катетера, закрепления второго шприц и обойтись 300 мкл воздуха в ступицу.
13. Заменить второеШприц с первым содержащий пузырь PBS. Пузырь будет продолжать расти и падать, если процедура была выполнена успешно.

3. постабортных Уход

1. Удалите катетер и ленту, и поместите животное в сухом теплом месте, пока он не приходит в сознание - как правило, в течение нескольких минут.

Результаты

Интубированы мышей контролировали ежедневно для потери веса и тесноты, и умерщвляли 4, 10 или 17 дней спустя с помощью внутрибрюшинного введения 2,5% 2,2,2 tribromoethanol. Бронхоальвеолярный лаважа (БАЛ) было собрано в три моет PBS, как описано в другом месте ²¹ и право?...

Обсуждение

В случаях, когда аэрозолизации непрактично из-за ограниченной доступности реагентов, безопасности или стоимости, непосредственное введение трахеи является превосходным способом доставки экзогенных агентов в легкие ¹⁶ транстрахеальная закапывания широко используется для дост?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps	N/A	N/A
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2ml Pipettor and Filter Tips	N/A	N/A
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board	N/A	N/A	See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen	N/A	N/A
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment	N/A	http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101