Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Riepilogo

Questo articolo presenta un metodo rapido e semplice per l'amministrazione bleomicina direttamente nella trachea del mouse tramite intubazione. I principali vantaggi di questo metodo sono che è altamente riproducibile, facile da padroneggiare, e non richiede attrezzature specializzate o tempi di recupero lunghi.

Abstract

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

Introduzione

Nonostante alcune differenze anatomiche e fisiologiche, ¹ modelli murini continuano ad essere prezioso per la modellazione di biologia umana e patogenesi della malattia. ² Dal punto di vista allevamento, i topi sono facili da gestire, hanno un basso tempo di allevamento, una durata di vita accelerato, e sono relativamente poco costoso a casa. Con lo sviluppo di diversi ceppi genetici e strategie (ad es., Condizionali knock-out, topi reporter, approcci lineage tracing, ecc), così come l'ampia gamma di reagenti disponibili (ad es., Anticorpi, proteine ​​ricombinanti, inibitori, ecc), i topi sono diventati un elemento essenziale organismo modello vertebrato per scoprire i processi di omeostasi e malattie umane. ³

I topi sono stati particolarmente preziosi per lo studio le malattie polmonari, tra cui lesione acuta polmonare (ALI) e fibrosi polmonare. ⁴ ALI negli esseri umani può essere causata da traumi, lesioni, o sepsi ed è caratterizzata da epiteliale eperdita endoteliale (es., edema), l'infiammazione e la fibrosi nascente. In molti pazienti, ALI progredisce nella sua forma grave, sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS), che si traduce spesso in fibrosi e la morte a causa di insufficienza respiratoria. ^5,6 fibrosi polmonare è una progressiva, una patologia fatale caratterizzata dall'eccesso deposizione di matrice extracellulare , in particolare collagene di tipo I, portando a deficit della funzionalità respiratoria. ^7,8 somministrazione di bleomicina (BLM) è il modello più diffuso e meglio caratterizzato per indurre ALI e fibrosi negli animali da esperimento. ⁹ Sebbene BLM-indotta fibrosi polmonare nei roditori fa non ricapitolare completamente i fenotipi umani fibrotiche, ^{10 studi} di topo con questo modello hanno portato alla scoperta di importanti fattori che influenzano l'insorgenza e la progressione della malattia. ¹¹

Mentre l'esatto meccanismo (s) dietro fibrogenesi BLM-indotta sono sconosciuti, il danno avvioè pensato per sorgere dal contatto-dipendente rotture del DNA nelle cellule epiteliali che rivestono le vie aeree di conduzione e alveoli, in particolare, di tipo 1 pneumociti. ¹² Il bisogno di contatto diretto tra BLM e l'epitelio polmonare mette in evidenza l'importanza di un robusto percorso di consegna , e queste preoccupazioni sono anche germano a una vasta gamma di trattamenti mirati per le vie aeree distali, tra cui proteine ​​ricombinanti, anticorpi, siRNA, virus, batteri, particelle, e altro ancora. Aspirazione orofaringeo (OPA) è stato ampiamente utilizzato per questo scopo ^{13, ma} un importante una lacuna di OPA è che una parte dell'agente erogata sia assorbito nel tratto gastrointestinale, determinando così imprecisione della dose somministrata. Un altro approccio ampiamente utilizzato è instillazione transtracheale, che coinvolge tracheostomia sotto forte anestesia per esporre la trachea e instillazione di un agente direttamente nelle vie respiratorie. ¹⁴ Tuttavia, non solo può taleuna procedura sia indesiderabile a causa della sua invasività, ma è anche in termini di tempo, richiede un bel po 'di allenamento, e provoca una lesione potente per le vie respiratorie sono stati sviluppati. ^15,16 Diversi protocolli che coinvolgono l'amministrazione diretta di agenti in trachea senza la necessità di un intervento chirurgico, ^{16,17,18,19,20} tempi di recupero ma questi metodi comportano estesi causato da anestetici potenti, l'uso di attrezzature costose (es., otoscope / laringoscopio, disponibili in commercio tavole procedura, fibra ottica fili, ecc), un eccesso di manipolazione nella cavità orale, l'incertezza del dosaggio.

Questo documento descrive un metodo relativamente semplice di somministrazione tramite intubazione che permette un ricercatore modo rapido, economico e affidabile infondere un reagente nel polmone murino con limitato rischio di danno residuo ai tessuti circostanti.

Protocollo

L'animale cura e l'uso comitati istituzionali (IACUC) presso l'Università di Washington e Cedars-Sinai Medical Center hanno approvato il lavoro degli animali necessari per questi studi.

1. Preparazione

1. Sterilizzare entrambe le pinze punta smussata e il divaricatore tramite autoclave.
2. Usando una cappa di sicurezza biologica, preparare uno stock di lavoro di BLM in PBS dalla polvere liofilizzata. Sonicare la soluzione per 10 minuti a 35 Khz per assicurare una miscelazione uniforme.
   Nota: Si raccomanda un volume totale di tra 30 e 45 ml per evitare variazioni pipettaggio sulla fascia bassa, e il soffocamento con volumi maggiori.
3. Preparare un lavoro pulito che comprende circa 1 m ² per la procedura stessa, così come luoghi designati per gabbie sia prima che dopo la procedura.
4. Fissare la base della tavola procedimento al banco immediatamente davanti ricercatore ponendo 2 o 3 strisce di nastro laboratorio attraverso la base e sottocaricoying panchina. Vedere la Figura 1 per ulteriori specifiche sulla creazione di un bordo.
5. Legare una sola lunghezza di dimensioni 4,0 filo di sutura tra le due viti di posizionamento della scheda procedura.
6. Generare uno spirometro improvvisato rimuovendo e scartando il pistone da tre 1 ml siringhe, e depositando 60 ml di PBS nella parte superiore di ciascun cilindro per formare una chiusura ermetica. Fissare il mozzo del catetere vagamente ad una delle siringhe e posizionarlo su un lato della tavola.
7. Aspirare 300 ml di aria in una siringa da 1 ml e posizionarlo su un lato della tavola.
8. Tagliare un pezzo aggiuntivo di nastro di circa 6 pollici di lunghezza e metterlo da parte. Questo verrà utilizzato per fissare l'animale alla scheda in fase 2.4.
9. Impostare una camera isoflurano. Attaccare O _2, isoflurano, e vuoto per porte appropriate sia sulla camera di esposizione ed il vuoto gioco. In alternativa, somministrare anestetico in un isoflurano compatibile biologicocappa di sicurezza.

2. intubazione

1. Anestetizzare il mouse con isoflurano nella camera fino a quando non perde conoscenza e la respirazione rallenta a un tasso adeguato. Un'esposizione tipico include 4% isoflurano e 2% O ₂ da 3 a 4 min, e il risultato ideale è 2 a 2,5 min di sedazione. Ciò corrisponde ad un tasso di respirazione di 1 respiro ogni 2 secondi.
2. In attesa che la sedazione per impostare in, aspirare tra 30 e 45 ml di BLM in una pipetta e metterlo da parte.
3. Quando si è pronti, sospendere il mouse sedato dai suoi incisivi superiori dal filo attaccato alle viti di posizionamento della piattaforma procedura. Assicurarsi che dorso dell'animale in posizione piana rispetto alla superficie della piattaforma.
4. Facendo attenzione a non limitare la ventilazione, posizionare un pezzo di nastro liberamente attraverso il (caudale) parte inferiore della cavità toracica, appena sopra il diaframma. Il posizionamento deve essere abbastanza stretto per mantenere il corretto allineamento durante il procedure, ma non così stretta che limita la respirazione.
5. Accendere l'illuminatore tra l'80% e il 100% di intensità e orientare il collo d'oca in modo che sia da 1 a 2 cm dalla superficie della pelle, vicino al plesso solare. Controllare periodicamente la punta di un collo d'oca per il calore per garantire che essa non danneggia il mouse.
6. In piedi dietro la piattaforma, utilizzare le sterili, pinze estremità smussata per individuare la lingua. Facendo attenzione ad evitare gli incisivi inferiori, delicatamente presa e disegnare la lingua fuori della cavità orale.
7. Utilizzando la mano rimanente, inserire il divaricatore e utilizzarlo per appiattire la lingua contro il pavimento della cavità orale. Rilasciare le pinze, ma lasciare il divaricatore sul posto per i due passaggi successivi.
8. Orientare la luce in modo che la trachea è visibile guidando il collo d'oca prossimalmente dal livello del plesso solare fino a raggiungere il livello dei bronchi mainstem.
   Nota: La trachea può essere facilmente distinta dall'azione della respirazione, WHIch provoca la luce emessa fluttuare in intensità. Quando posizionato correttamente, questa struttura sarà distinguibile nel piano assiale di un perno centrale di luce con luce ambientale minimo nella cavità orale stessa.
9. Angle la siringa in modo che segua il percorso naturale della trachea, e abbassare la punta del catetere 22-G, con la siringa attaccata contenente la gocciolina, direttamente nel lume. La bolla PBS inizierà a salire e scendere ad ogni respiro sul posizionamento di successo.
   Nota: Questa azione può essere ritardata di alcuni secondi a causa della sedazione profonda.
10. Nutrire il catetere in un ulteriore 5 mm. Rimuovere la abbassalingua.
11. Spostare la siringa per la mano opposta, e impugnando il mozzo, rimuovere delicatamente la siringa.
12. Deposito tra 30 e 45 ml di BLM nel centro dell'interno del mozzo del catetere, collegare la seconda siringa ed erogare 300 microlitri di aria nel mozzo.
13. Sostituire il secondosiringa con il primo contenente la bolla di PBS. La bolla continuerà a salire e scendere se la procedura è stata eseguita con successo.

Cura 3. post-procedurale

1. Rimuovere il catetere e il nastro, e mettere l'animale in un luogo caldo e asciutto fino a quando non riprende conoscenza - di solito entro un paio di minuti.

Risultati

Topi intubati sono stati monitorati giornalmente per la perdita di peso e di angoscia, e si sono sacrificati 4, 10 o 17 giorni dopo tramite iniezione intraperitoneale di 2,5% 2,2,2- tribromoethanol. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è stato raccolto in tre lavaggi di PBS come descritto altrove ²¹ , e il polmone destro è stato fissato in formalina 10%, inclusi in paraffina, e colorati con tricromica di Masson dalla University of Washington Istologia ed Imagi...

Discussione

Nei casi in cui aerosol è impraticabile a causa della limitata disponibilità di reagente, la sicurezza, o il costo, amministrazione diretta tracheale è un metodo superiore per la consegna degli agenti esogeni nei polmoni ¹⁶ transtracheale instillazione è stato ampiamente utilizzato per raggiungere questo obiettivo.; Tuttavia, come con tutti gli interventi chirurgici, porta con sé anche il potenziale di complicazioni causate dalla procedura stessa, e non necessariamente l'agente essendo instillato.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps	N/A	N/A
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2ml Pipettor and Filter Tips	N/A	N/A
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board	N/A	N/A	See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen	N/A	N/A
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment	N/A	http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101