마우스의기도 신속 삽관 용 개선 된 방법

요약

이 문서에서는 삽관을 통해 마우스 기관에 직접 블레오 마이신 관리를위한 신속하고 간단한 방법을 제공합니다. 이러한 방법의 주요 장점은 마스터 높은 재현성 쉽고, 특수 장비 나 긴 회복 시간을 요구하지 않는다는 점이다.

초록

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

서문

일부 해부학 적 생리 학적 차이에도 불구하고, ¹ 뮤린 모델 사육 관점에서 인간 생물학 및 질환 발병. ² 모델링 헤아릴 수, 마우스, 취급하기 쉬운 낮은 사육 시간 가속 수명을 가지며, 상대적으로 저렴 계속 집입니다. 다양한 유전자 변형 전략 (예., 조건부 녹아웃 리포터 마우스 계통 추적 방법 등)뿐만 아니라, 가능한 시약의 다양한 (예., 항체, 재조합 단백질 억제제의 개발과 함께, 등), 마우스는 인간의 질병 및 항상성 과정을 밝히기 위해서 필수적인 모델 척추 생물되었다. ⁽³⁾

마우스는 인간의 ⁴ ALI는 외상, 부상 또는 패혈증으로 인해 발생할 수 있습니다. 급성 폐 손상 (ALI) 및 폐 섬유증을 포함한 폐 조건을 공부에 특히 유용되었습니다 상피을 특징으로하고내피 누출 (예., 부종), 염증 및 초기 섬유화. 많은 환자에서 ALI 종종 인한 호흡 부전으로 사망 섬유증 결과의 중증 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)으로 진행한다. ^5,6- 폐 섬유증은 세포 외 기질의 과잉 증착 특징 진보적 인 심각한 병리학 , 특히. 나는 장애인 폐 기능을 선도, 콜라겐 블레오 마이신 (BLM)의 ^7,8 관리를 입력 한 실험 동물에 ALI 및 섬유화를 유도하기 위해 가장 널리 사용되는 최고의 특성화 된 모델입니다. ⁽⁹⁾ 설치류에 폐 섬유증을 BLM 유발하지만 않습니다 완전히 인간의 섬유 성 표현형은,이 모델 ⁽¹⁰⁾ 마우스 연구는 발병과 질병의 진행에 영향을 미치는 여러 중요한 요인의 발견을 주도 요점을 되풀이하지. ⁽¹¹⁾

BLM 유도 섬유화 뒤에 정확한 메커니즘 (들)를 알 수 있지만, 개시 부상전도기도 및 폐포, 특히 제 1 형 pneumocytes 라이닝 상피 세포의 접촉에 의존하는 DNA 가닥 나누기에서 발생하는 것으로 생각된다. ⁽¹²⁾ BLM과 폐 상피 세포 사이의 직접 접촉에 대한 필요성은 강력한 전달 경로의 중요성을 강조 그리고 이러한 우려는 재조합 단백질, 항체, siRNA를, 바이러스, 박테리아, 미립자 등을 포함한 말초기도를 대상으로 치료의 넓은 범위에 밀접한 있습니다. 인두 흡인 (OPA)는 이러한 목적 ¹³ 널리 사용되었지만, OPA의 주요 단점은 전달 제의 일부가되어 투여 용량으로 부정확 선도 위장관으로 삼킬 수 있다는 것이다. 널리 사용되는 또 다른 방법은 직접 호흡기에 제의 기관지 점적 및 노출 강한 마취 기관 절개술을 포함 transtracheal 점안이다. ⁽¹⁴⁾ 그러나, 그러한 수도절차 인해 invasivity에 바람직하지 않을 수 있지만, 또한, 시간 소모적 인 훈련 공정한 비트가 필요하며으로 제제의 직접 투여를 포함한다. ^15,16 여러 프로토콜들이 개발되었다 호흡기 잠재적 손상을 일으키는 수술 개입 없이도기도가 ^{16,17,18,19,20} 그러나 이러한 방법은 확장 된 것을 포함 복구 시간 강력한 마취제로 인한 고가 장비의 사용 (예., 이경 / 후두경 시판 절차 보드, 광섬유 투여 량에 관한 와이어 등), 구강 조작 과량 불확실성.

이 논문은 연구자가 신속, 저렴하고 안정적​​으로 주변 조직에 잔류 손상의 제한으로 위험 쥐의 폐에 시약을 주입 할 수 있습니다 삽관을 통한 행정의 비교적 쉬운 방법을 설명합니다.

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프로토콜

미국과 삼목 시나이 의료 센터의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)는 이러한 연구에 필요한 동물 작업을 승인했다.

1. 준비

1. 무딘 엔드 집게와 억압자를 통해 오토 클레이브를 모두 소독.
2. 생물 안전 캐비닛을 사용하여 동결 건조 분말 PBS에서 BLM의 작업 주식을 준비합니다. 혼합조차 보장 35 kHz에서 10 분 동안 초음파 처리 용액.
   참고 : μL (30) 사이에 45의 총 부피는 큰 볼륨과 피펫의 로우 엔드에 변화하고, 질식을 방지하는 것이 좋습니다.
3. 약 1 절차 자체에 대한 ^평방 미터뿐만 아니라 전 시술 후 모두 케이지에 대한 지정된 위치를 포함하는 깨끗한 작업 공간을 준비합니다.
4. 베이스와 underl를 통해 실험실 테이프의 2 또는 3 스트립을 마련하여 즉시 연구원 앞의 벤치에 프로 시저 보드의 기본 수정벤치 잉. 보드를 만드는 방법에 대한 자세한 사양은 그림 1을 참조하십시오.
5. 절차 기판의 두 개의 위치 사이의 나사 크기 4.0 봉합 실의 단일 길이 넥타이.
6. 제거하고 1 ㎖의 세 주사기에서 플런저를 폐기하고, 기밀 밀봉을 형성하여 배럴의 상부에 PBS 60 μL를 증착함으로써 임시 폐활량계를 생성한다. 느슨하게 주사기 중 하나에 카테터의 허브를 안전하고 보드의 한쪽에 놓습니다.
7. 1 ML의 주사기에 공기의 흡인 300 μL와 보드의 한쪽에 놓습니다.
8. 한쪽으로 테이프 길이와 장소에 약 6 인치의 추가 조각을 잘라. 이 단계 2.4 보드 동물을 보호하는 데 사용된다.
9. 이소 플루 란 실을 설정합니다. 노출 챔버와 통관 진공 모두에서 해당 포트에 O _(2), 이소 플루 란, 진공을 연결합니다. 또는에서 마취를 관리 이소 플루 란 호환 생물학적안전 캐비닛.

2. 삽관

1. 이 의식을 잃고 호흡이 적절한 속도로 감속 할 때까지 실에서 이소 플루 란과 마우스를 마취. 전형적인 노출 3-4 분 동안 4 % 이소 플루 란 2 % O _2를 포함하고, 최적의 결과는 마취 2-2.5 분이다. 이 한 숨을 2 초마다의 호흡 속도에 해당한다.
2. 한쪽으로 피펫과 장소에 BLM 30, 45 μl의 사이에 설정하는 진정 작용, 흡인 기다리는 동안.
3. 준비가되면, 절차 플랫폼의 위치에 장착 나사 스레드에서 상부 앞니에 의해 마우스를 진정 중단. 동물의 배부 플랫폼 표면에 평평하게 놓여 있는지 확인합니다.
4. 환기를 제한하지 않도록주의이기 때문에, 그냥 진동판 위에 느슨하게 흉강의 하단 (꼬리) 부분에서 테이프의 조각을 놓습니다. 위치는 PROC 동안 적절한 정렬을 유지하기 위해 꽉 충분해야한다edure하지만 호흡을 제한 너무 꽉 없습니다.
5. 80 % 내지 100 %의 강도로 조명을 켜고 명치 부근의 피부 표면 1~2cm,되도록 거위의 방향. 주기적으로 마우스를 손상하지 않도록 열을 위해 거위의 끝을 확인합니다.
6. 플랫폼 뒤에 ​​서, 혀의 위치를​​ 살균, 무딘 엔드 집게를 사용합니다. 아래 앞니, 부드럽게 그립을 방지하고 구강 밖으로 혀를 그릴 조심.
7. 나머지 손을 사용하여, 억압 물을 넣고 구강의 바닥에 평평하게 혀를 사용. 집게를 해제하지만 다음 두 단계를위한 장소에 억압자 둡니다.
8. 기관지 그것이 mainstem 기관지의 수준에 도달 할 때까지 명치의 레벨로부터 근위 거위 안내하여 볼 수 있도록 빛의 방향.
   주 : 기관지 용이 호흡 작용에 의해 구별 될 수 있으며, WHI채널은 강도가 변동하는 방출되는 빛을 발생합니다. 정확하게 위치 할 때,이 구조는 구강 자체 최소한의 주변 조명과 빛의 중앙에 위치한 핀과 같은 축 평면에서 식별 할 수 있습니다.
9. 각도가 직선 루멘, 액 적을 함유 연결된 주사기, 기관의 천연 경로를 따르며, 22-G 카테터 팁을 낮추도록 주사기. PBS 거품이 상승하고 성공적인 위치에 따라 각각의 호흡과 가을에 시작됩니다.
   참고 :이 작업은 깊은 진정 작용의 결과로 몇 초 정도 지연 될 수 있습니다.
10. 추가 5mm에서 카테터 피드. 혀를 제거 억압자.
11. 부드럽게 주사기를 제거, 반대 손으로 주사기를 이동하고, 허브를 파지.
12. 카테터 허브의 내부의 중심으로 BLM 30 45 μL 사이 금고는 제 2 주사기를 연결하고 허브에 공기의 300 μL 분주.
13. 두 번째 교체제 PBS의 기포를 함유하는 주사기. 거품 상승과 절차가 성공적으로 수행 된 경우 떨어질 것입니다.

3. 후 절차 케어

1. 카테터 및 테이프를 제거하고 의식을 회복 할 때까지 건조 따뜻한 장소에서 동물을 배치 - 일반적으로 몇 분 내에.

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결과

삽관 마우스는 체중 감소와 고통에 대해 매일 모니터링, 2.5 % 2,2,2- tribromoethanol의 복강 내 주사를 통해 4, 10 또는 제 17 일 후에 희생되었다. 기관지 폐포 세척액 (BAL)는 PBS 세 세척에 수집 된 ²¹ 곳 바와 같이 , 오른쪽 폐는 10 % 포르말린에 고정 된 파라핀, 워싱턴 조직학 및 이미징 코어 ^(22)의 대학에 의해 메이슨의 트리 크롬 염색 하였다.

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토론

에어로졸 인해 제한 시약 가용성, 안전성, 또는 비용이 비현실적 경우에, 직접 기관 행정부는 폐에 외인성 에이전트의 전달을위한 우수한 방법이다 ¹⁶ Transtracheal의 점안이 광범위하게이 작업을 수행하는 데 사용되었습니다.; 그러나, 모든 외과 적 개입, 그것은 또한 그것 절차 자체에 의한 합병증의 가능성을 수행하고, 반드시 제가 주입된다. ⁽¹³⁾ 이러한 이유로, 삽관...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2 ml Pipettor and Filter Tips
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board			See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment		http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101