マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

要約

この記事では、挿管を経由して、マウスの気管に直接ブレオマイシンを投与するための迅速かつ簡単な方法を提示します。この方法の主な利点は、習得が容易で、それは非常に再現可能であることであり、特殊な装置または長い回復時間を必要としません。

要約

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

概要

畜産観点からいくつかの解剖学的および生理学的な違いにもかかわらず^、1マウスモデルは、ヒトの生物学と疾患の病因をモデル化するための非常に貴重であり続ける^。2、マウスは、取り扱いが容易で低繁殖時間を持って、加速寿命、かつ比較的安価です家へ。多様な遺伝的系統と戦略（ 例えば 、条件付きノックアウト、レポーターマウス、系統追跡手法など）、ならびに入手可能な試薬の広い範囲（ 例えば 、抗体、組換えタンパク質、阻害剤の開発と、等）、マウスは、ヒト恒常性と疾患過程を明らかにするために不可欠なモデル脊椎動物の生物となっている^。3

マウスはヒトで⁴ ALIは、外傷、傷害、または敗血症によって引き起こされ得る。急性肺損傷（ALI）および肺線維症などの肺の状態を研究するために特に有益であったと上皮を特徴とし内皮リーク（ すなわち、浮腫）、炎症、および新生線維症。多くの患者では、ALIは、その重篤な形態、しばしば線維症、呼吸不全のために死をもたらす急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、へと進行する^。5,6肺線維症は、細胞外マトリックスの過剰沈着を特徴とする進行、致命的な病態であります、最も顕著に私が損なわ肺機能につながる、型コラーゲン。ブレオマイシンの^7,8管理局（BLM）は、実験動物でALIおよび線維症を誘導するための最も広く使用されていると最もよく特徴付けられたモデルである^。9げっ歯類におけるBLM誘発肺線維症はありませんが、完全にヒトの線維性の表現型を再現ではない、このモデルと¹⁰マウス研究は、疾患の発症と進行に影響を与える多くの重要な要因の発見につながっている^。11

BLM誘発性線維形成の背後にある正確なメカニズム（s）は不明であるが、開始けが誘導気道および肺胞、特に、1型肺の内側を覆う上皮細胞における接触依存性DNA鎖切断に起因すると考えられる^。12 BLMおよび肺上皮との間の直接接触の必要性は、頑強な送達経路の重要性を強調、およびこれらの懸念はまた、組換えタンパク質、抗体、siRNAを、ウイルス、細菌、微粒子、および多くを含む遠位気道を標的とする治療法の広い範囲に密接な関係がある。口腔咽頭吸引（OPA）が広く、この目的の¹³のために使用されてきたが、OPAの主な欠点は、送達される薬剤の一部がそれによって投与量に不正確さをもたらす、胃腸管に飲み込むことができることです。もう一つの広く使用されているアプローチは、直接気道への薬剤の気管や点滴を露出するために強力な麻酔下で気管切開を伴う経気管点滴、である^。14しかし、だけでなく、そのようなよいです手順、その浸 ​​潤性に望ましくないこと、それはまた、時間がかかり、訓練の公平なビットを必要とし、気道に対して強力な障害を引き起こします^。15,16、いくつかのプロトコルが開発されているに薬剤の直接投与を含みます外科的介入を必要とせずに気管^{、16,17,18,19,20}が、これらの方法は、強力な麻酔薬によって引き起こされる長期の回復時間、高価な装置（ すなわち 、耳鏡/喉頭鏡、市販の手順ボード、光ファイバの使用を含みます投与量に関しては、ワイヤなど）、口腔内での操作の過剰、および不確実性。

本論文では、研究者が迅速、安価に、かつ確実に周囲の組織への残留損傷の限定されたリスクとマウスの肺に試薬を植え付けることができます挿管による投与の比較的容易な方法を記載しています。

プロトコル

ワシントンとシーダーズ・サイナイ医療センターの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、これらの研究のために必要な動物の作業を承認しました。

1.準備

1. 平滑末端鉗子と降圧介してオートクレーブの両方を滅菌します。
2. 生物学的安全キャビネットを使用して、凍結乾燥粉末からPBSでBLMの作業ストックを準備します。偶数混合を確実にするために35 kHzで10分間この溶液を超音波処理します。
   注：μlの30〜45の総容量は、より大容量で、ピペットローエンドのバリエーション、および窒息を防ぐために推奨されます。
3. 手順自体は約1メートル^{2を備えて}クリーンなワークスペースを準備し、同様の手順の前と後の両方のケージの場所を指定。
4. ベースとunderl渡って実験用テープの2または3のストリップを置くことによって、直ちに研究者の前でベンチに手続きボードのベースを修正しました。英ベンチ。ボードの作成 ​​に関する更なる仕様については、図1を参照してください。
5. 手順ボードの2つの位置決めねじのサイズ4.0縫合糸の単一の長さを接続します。
6. 削除し、3 1ミリリットルのシリンジからプランジャーを破棄し、気密シールを形成するために、各バレルの上部にPBSを60μlを堆積させることにより、その場しのぎの肺活量計を生成します。シリンジの1に緩くカテーテルのハブを固定し、基板の一方の側に配置します。
7. 1mlシリンジ内への空気の吸引し、300μlのとは、基板の一方の側に配置します。
8. 一辺までの長さと場所で約6インチテープの追加部分をカット。これは、ステップ2.4​​でボードに動物を保護するために使用されます。
9. イソフルラン室を設定します。露光室とクリアランス真空の両方で適切なポートに、O _2、イソフルラン、真空を取り付けます。また、イソフルラン互換生物学的に麻酔薬を投与します安全キャビネット。

2.挿管

1. それは意識を失い、呼吸が適切な速度に減速するまで、チャンバ内でイソフルランでマウスを麻酔。典型的な曝露は、3〜4分間、4％イソフルランおよび2％O _{2を含み、}理想的な結果は、鎮静の2〜2.5分です。これは、すべての2秒1呼吸の呼吸速度に対応しています。
2. 片側にピペッター、所定の位置にBLMの30と45μlの間に設定するには、鎮静、吸引を待っている間。
3. 準備ができたら、手順プラットフォームの位置決めネジに取り付けられたスレッドからその上顎切歯によって鎮静させたマウスを一時停止します。動物の背側は、プラットフォーム表面に対して平らにすることを確認してください。
4. 換気を制限しないように注意しながら、ちょうど横隔膜の上、緩く胸腔の下（尾）部分を横切ってテープ片を配置します。配置は、procの中に適切な位置合わせを維持するのに十分タイトであるべきですedureが、それは呼吸を制限することは非常にタイトではありません。
5. 80％の間と100％の強度に照明をオンにして、それは太陽神経叢の近くに、皮膚の表面から1〜2cm程度になるように、グース​​ネックを向けます。定期的にマウスを傷つけることがないように、熱のためのグースネックの先端を確認してください。
6. プラットフォームの後ろに立ち、舌を見つけるために、滅菌、平滑末端の鉗子を使用しています。下の切歯、軽くグリップを回避し、口腔外に舌を描くように注意しながら。
7. 残りの手を使用して、圧子を挿入し、口腔内の床面に対して舌を平らにするためにそれを使用。鉗子を解放しますが、次の2つの手順のための場所で圧子を残します。
8. オリエント光気管は、それがmainstem気管支のレベルに達するまで太陽神経叢のレベルから近位グースネックを案内することにより、表示されるように。
   注：気管を簡単に呼吸の作用によって区別することができ、WHIchが放出された光は強度が変動する原因となります。正しく配置すると、この構造体は、口腔自体に最小限の環境光の光の中心に位置するピンとして軸平面に識別可能になります。
9. 角度シリンジそれは気管の自然な経路をたどる、とストレート内腔に、液滴を含む添付のシリンジを用いて、22-Gのカテーテル先端を下げるようにします。 PBSバブルが成功した配置時に各呼吸と共に上昇し、秋に開始されます。
   注：このアクションは、深い鎮静の結果として数秒遅れで表示することができます。
10. 追加の5ミリメートルにカテーテルを養います。舌を取り外し圧子。
11. 反対側の手に注射器をシフトし、ハブを把持し、静かに注射器を取り外します。
12. カテーテルハブの内部の中心部へのBLMの30と45μlの間の預金は、第2のシリンジを接続し、ハブへの空気の300μLを分注します。
13. 第二を交換しますPBSの気泡を含有する第一と注射器。バブルが上昇し、プロシージャが正常に実行された場合に落下していきます。

3.ポスト手続きケア

1. カテーテルとテープを取り外し、それが意識を取り戻すまで、乾燥した暖かい場所に動物を置く - 通常、数分以内に。

結果

挿管マウスは2.5％2,2,2- トリブロモエタノールの腹腔内注射を介して、10または17日後に、体重減少及び苦痛を毎日モニターし、4を屠殺した。他の場所²¹に記載のように気管支肺胞洗浄 （BAL）は、PBSの3回の洗浄で回収しました、および右肺は、10％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、ワシントン組織学とイメージングコア²²の大学の?...

ディスカッション

エアロゾル化が原因で制限された試薬の利用可能性、安全性、またはコストに実用的ではない例において、直接気管内投与は、肺への外因性薬剤の送達のための優れた方法である¹⁶経気管点滴注入が広くこれを達成するために使用されています。しかしながら、すべての外科的介入と同様に、それはまた、それを使用して手順自体に起因する合併症の可能性を運び、そして必ずしも薬...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin For Injection, 30 units/vial	APP Pharmaceuticals, LLC	103720	For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots
Blunt End Forceps	N/A	N/A
Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4")	Covidien	E1551G	Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm  from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions.
Exel Safelet Catheter 22G X 1"	Exel International	26746
1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca)	BD	309659
0.2ml Pipettor and Filter Tips	N/A	N/A
Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator	Dolan Jenner Industries, Inc.	181-1	Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea.
Intubation Board	N/A	N/A	See Diagram 1.
Colored Label Tape: 0.5 in. Wide	Fisherbrand	15-901-15A
Oxygen	N/A	N/A
Phosphate-Buffered Saline, 1X	Corning	21-040-CV	Product should be sterile
Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0	Harvard Apparatus	517698
Table Top Anesthesia Machine Isoflurane	Highland Medical Equipment	N/A	http://www.highlandmedical.net/
Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber	MIP / Anesthesia Technologies	AS-01-0530-SM
FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL	Baxter	1001936040
Nanozoomer Digital Pathology system	Hamamatsu
IgM ELISA Quantification Kit	Bethyl Laboratories	E90-101