利用miRNA的miRNA表达的临床病理分析乳腺癌组织<em&gt;原位</em&gt;杂交

摘要

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

摘要

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

引言

乳腺癌是影响世界各地的女性人口中最常见的恶性肿瘤之一。超过130万例乳腺癌，每年全世界^1,2报告。虽然肿瘤细胞已被传统上被视为生物学均匀和高度增殖，它已成为明显的是，乳腺癌是遗传和临床异质性。耐流行抗癌药物是先进乳腺癌的标志，导致通过它的癌症进展和远处转移³的便利在大多数患者的死亡率。

微RNA（miRNAs）是一类通过阻断mRNA翻译或介导的mRNA降解⁴调节基因表达的小RNA分子约22个核苷酸长的。超过2000种不同的miRNA迄今已在人类中，它们与人类疾病⁵识别。越来越的研究阵列甲肝Ë证实的miRNA可以作为癌基因和肿瘤抑制基因的功能，并且经常在肿瘤中⁶失调。通过控制细胞周期进程，衰老，凋亡和自噬的主要调节的miRNA强烈影响所有初级肿瘤发生的，与这些肿瘤细胞运动性，侵入和转移⁷的沿。

miRNA表达异常，已与临床意义，如分期，分化程度，预后和应对辅助治疗⁸也被相关。特别是，增加的miR-146表达与肺癌患者⁹预后差相关。另一项研究已经证明了miRNA-let7b失去表达是与恶性表型，因此，生存差^6。理解表达的miRNA在细胞类型和结构是理解机制的重要组成部分，通过它miRNA表达影响细胞改变和组织表型^10。发现在基质细胞被分泌某些miRNA的取在由上皮细胞并在它们的靶标特异性作用。本着同样的精神中，miR-212和miR-132是由间质分泌和调节乳腺发育¹¹期间导管生长所需的上皮-间质相互作用。本文的总体目标是解释一个详细的协议，并通过miRNA的原位杂交技术检测乳腺癌组织中的miRNA表达。我们优化所有条件以测定乳腺癌患者样品中的miRNA-489的表达水平。为此，我们使用标有DIG在我们的实验锁核酸（LNA）探针。它的一些核苷酸的有一个LNA修饰，即，亚甲基桥连接的2'氧原子和4'核糖主链固定，使得它保持"锁定就位"杂交后的碱基的碳原子上。其结果，这是更为困难用于杂交复合变性^12,13。

研究方案

这项研究是经全南大学和顺医院的机构审查委员会和南卡罗来纳大学。乳腺癌旁正常乳腺组织组成的TMA样品进行了全南国立大学和顺医院，韩国生物库网络的成员的生物银行提供的。

1.溶液的制备

1. 准备1升DNA酶和RNA酶自由水。请使用酸二乙酯（DEPC）处理过的水的所有化学解决方案。治疗1升水中，用500μL的DEPC孵育在室温下3小时。高压灭菌水以灭活DEPC。
   注意:不要吸入DEPC因为它是已知的致癌物质。
2. 用DEPC处理过的水从10倍PBS准备1X PBS。
3. 制备20×SSC（溶解175.3克NaCl和在800毫升水88.2克柠檬酸钠，用盐酸的14 N溶液几滴调节pH至7.0并定容至1L用笏尔），4％多聚甲醛，95％乙醇，80％的乙醇用DEPC处理过的水。
4. 加入8毫升三乙醇胺和1.05 590毫升DEPC处理过的水的毫升盐酸，并添加1.5毫升乙酸酐乙酰化。
5. 在缓冲液制备50微克/微升蛋白酶K（50毫摩尔Tris盐酸，于DEPC pH 8.0的处理过的水）。
6. 制备的500微升甲酰胺，250微升20×SSC，100微升的50×Denhardt氏溶液，12.5微升叔RNA的，2.5微升鲱鱼精DNA，RVC 30微升和0.02克封闭试剂和50微升的组成的杂交缓冲DEPC的水。准备好新鲜。

2.乳腺组织切片

1. 切5μm的福尔马林固定，石蜡包埋切片用切片机和适用于充电幻灯片¹⁴上的部分。
   注意:这里使用的乳腺组织是从韩国生物库网络事先准备好的。

3.组织准备

1. 除去来回石蜡浸渍滑入科普林缸2倍在新鲜的二甲苯10分钟每m为组织和再水合5分钟孵育的组织切片中在DDH ₂ O递减的乙醇（100％，95％和80％）浓度执行在通风橱中此步骤。
2. 沉浸于DEPC所述组织处理水5分钟。在这一点上使周围疏水屏障笔组织切片边界。
3. 固定用4％PFA的组织15分钟，随后用PBS洗涤。
4. 浸入所述组织中的0.3％的Triton X-100 / PBS中进行10分钟，随后用PBS洗涤。
5. 孵育样品与在37℃下50微克/微升蛋白酶K溶液15分钟。然后孵育用三乙醇胺和乙酸酐的组织切片，在室温下5分钟，随后用PBS洗涤。没有的PBS洗涤是必需的蛋白酶K处理和三乙醇胺/乙酸酐处理之间。

4.杂交

1. 彻底洗净INCU组织软化的组织切片在室温下用杂交缓冲液进行2至3小时。通常为120微升杂交缓冲液是足以覆盖组织切片。
2. 稀释5'-DIG标记LNA探针在120微升杂交液15:00的终浓度。作为原料浓度通常为40纳克/微升，加入3微升的库存120微升杂交缓冲液，并在95℃下孵育混合物5分钟。
3. 在潮湿室孵育在54°C（Tm）的带探头一夜之间组织切片。通常情况下120微升足以覆盖一个部分。通过使用两个湿纸巾创建湿度。室的理想的尺寸是8英寸10英寸。
4. 注意:Tm为可能是不同的miRNA不同。 54℃是用于提的miR-489。

5.严格清洗

1. 洗5倍SSC组织7分钟（杂交步骤后，RNA酶条件是不再需要）。
2. 洗净组织切片机智^ h 1X SSC在57℃7分钟两次。
3. 在57℃下接触，用0.2X SSC组织切片7分钟。
4. 洗用0.2×SSC的组织切片，在室温下7分钟。
5. 孵育在PBS组织切片10分钟。

6.阻塞

1. 孵育所述组织部分与在潮湿室（为了使​​封闭缓冲液中加2ml胎牛血清，10微升吐温20和3微升的BSA在18米PBS中。保存在4封闭缓冲液阻断在室温下缓冲液1小时 C）。

7.一抗孵化和发展

1. 稀释1:300的抗DIG-AP抗体在封闭缓冲液并在4℃孵育用抗体的组织切片过夜。
2. 用洗涤缓冲液洗切片3次，每次5分钟（通过显影试剂盒中提供缓冲液）。
3. 开发与碱性磷酸酶商业试剂盒产生CY-3荧光灯的组织切片。
<利>清洗用洗涤缓冲液的部分5分钟。染色部用100μl2.5毫微克/微升的Hoechst染料的5分钟，然后用5分钟洗涤用洗涤缓冲液。
4. 安装具有根据制造商的协议安装缓冲器的部分。使用每个组织切片15微升，并擦拭组织的过度安装溶液擦拭。密封采用透明指甲油，以防止泄露的幻灯片。
5. 观察与10X镜头所以总放大倍率使用部分荧光显微镜100X。

结果

人乳腺癌组织用于测定的miRNA-489的表达。乳腺腺管和上皮细胞被发现表达显著较高的miRNA-489比两个相邻的患者肿瘤组织（1B 图1A和）的水平。这清楚地表明了miRNA-489的表达已在肿瘤组织中丢失了，表明miRNA的-489的肿瘤抑制活性。为了进一步证实来自同一患者这些结果，肿瘤组织和邻近的正常组织进行比较。如在图2A和2B观?...

讨论

本研究的目的是确定在原位杂交使用的miRNA乳腺癌组织的miRNA的表达水平。必须指出，在该实验中，所有条件为乳腺癌组织优化。进一步的优化可能需要的其它类型的组织。所有解决方案必须用DEPC水进行，也可以使用所有的容器应用DEPC处理过的水冲洗，随后高压灭菌。即使是轻微的RNase污染可以用实验的最终结果产生干扰。作为miRNA的是一个非常短的序列，其有必要使用的LNA探针，以便于与...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ELF-97	Life technology	E6604
50x Denhard't	Life technology	750018
t-RNA	Roche	109541	Reconstitute in DEPC water
Herring Sperm DNA	Promega	D1815
Roche Blocking	Roche	11096176001
RVC	Fisher	50-812-650	Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant
miR-489 probe	Exiqon	38599-01
Nuclease free BSA	Roche	711454
Primary antibody-anti DIG	Roche	11093274910
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	1609478