Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

Resumen

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

Resumen

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Introducción

El cáncer de mama es una de las neoplasias más comunes que afectan a la población femenina en todo el mundo. Más de 1,3 millones de casos de cáncer de mama cada año se registran en todo el mundo ^1,2. Aunque las células tumorales han sido tradicionalmente considerado como biológicamente homogénea y altamente proliferativas, se ha hecho evidente que el cáncer de mama es genéticamente y clínicamente heterogéneos. La resistencia a medicamentos contra el cáncer prevalentes es una característica de los cánceres de mama avanzados, que conduce a la mortalidad en la mayoría de los pacientes a través de su facilitación de la progresión del cáncer y la metástasis a distancia ^3.

MicroARNs (miRNAs) son una clase de moléculas de ARN pequeñas de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que regulan la expresión génica mediante el bloqueo de la traducción del ARNm o la mediación de la degradación del ARNm ^4. Más de 2.000 diferentes miRNAs Hasta ahora se han identificado en humanos, que están vinculados a enfermedades humanas ^5. Un creciente gama de estudios VHAe demostró que los miRNAs pueden funcionar como oncogenes y supresores tumorales y son a menudo mal regulada en tumores ^6. miRNAs afecta fuertemente la totalidad de la tumorigénesis primaria mediante el control de los principales reguladores de la progresión del ciclo celular, la senescencia, la apoptosis y la autofagia, junto con los de la motilidad de células tumorales, invasión y metástasis ^7.

La expresión aberrante de los genes miARN se ha asociado también con implicaciones clínicas como la etapa, la diferenciación, el pronóstico y respuesta al tratamiento adyuvante ^8. En particular, el aumento de expresión de miR-146 se correlaciona con mal pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón ^9. Otro estudio ha demostrado que la expresión perdida de miARN-let7b está vinculada a fenotipos malignos y, en consecuencia, una baja supervivencia ^6. La comprensión de los tipos de células y estructuras que expresan miRNAs es una parte importante de la comprensión de los mecanismos a través del cual las alteraciones en la célula de influir en la expresión de los genes miARN ytejido fenotipos ^10. Ciertos miRNAs encontrado para ser secretada en las células del estroma se toman en por las células epiteliales y actúan específicamente sobre sus objetivos. En la misma línea, el miR-212 y miR-132 son secretadas por estroma y regulan las interacciones epitelio-estroma necesarios para derivación ductal durante el desarrollo de la glándula mamaria ^11. El objetivo general de este trabajo es explicar un protocolo detallado para detectar la expresión de los genes miARN en tejidos de cáncer de mama a través de miRNA hibridación in situ. Hemos optimizado todas las condiciones para someter a ensayo los niveles de expresión de los genes miARN-489 en muestras de pacientes con cáncer de mama. Con este fin, se utilizó una DIG marcado bloqueado sonda de ácido nucleico (LNA) en nuestro experimento. Algunos de sus nucleótidos tenían una modificación LNA, es decir, un puente de metileno que conecta 'átomo de oxígeno y 4' de la 2 átomo de carbono del esqueleto de ribosa que fija el nucleótido de tal manera que permanece "bloqueado en su lugar" después de la hibridación. Como resultado, es mucho más difícilpara el complejo hibridado para desnaturalizar ^12,13.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad Nacional de Chonnam Hwasun y la Universidad de Carolina del Sur. TMA muestras compuestas de cáncer de mama y tejidos de mama normales adyacentes emparejados fueron proporcionados por el Biobanco del Hospital Hwasun Chonnam Universidad Nacional, un miembro de la Red de Biobancos Corea.

1. Preparación de la solución

1. Preparar 1 l de DNasa y RNasa libre de agua. Realiza todas las soluciones químicas mediante el uso de dietilo (DEPC) de agua tratada. Tratar 1 L de agua con 500 l de DEPC y se incuba durante 3 horas a temperatura ambiente. Autoclave el agua para inactivar DEPC.
   Precaución: No se requieren medidas DEPC ya que es conocido carcinógeno.
2. Preparar 1x PBS 10x de PBS utilizando agua tratada con DEPC.
3. Preparar 20x SSC (disolver 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de sodio en 800 ml de agua, ajustar el pH a 7,0 con unas pocas gota de 14 N solución de HCl y ajustar el volumen a 1 L con water), 4% de paraformaldehído, 95% de etanol, 80% de etanol con agua tratada con DEPC.
4. Añadir 8 ml de trietanolamina y 1,05 ml de HCl en 590 ml de agua tratada con DEPC y añadir 1,5 ml de anhídrido acético para la acetilación.
5. Preparar 50 g / l de proteinasa K en tampón (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 en DEPC agua tratada).
6. Preparar tampón de hibridación compuesto por 500 l de formamida, 250 l de 20x SSC, 100 l de 50x solución de Denhardt, 12,5 l de t-RNA, 2.5 l de ADN de esperma de arenque, 30 l de RVC, 0,02 g de reactivo de bloqueo y 50 l de agua DEPC. Preparar fresco.

2. Las secciones de tejido de mama

1. Cortar 5 micras secciones incluidas en parafina fijadas con formalina con microtomo y aplicar la sección ¹⁴ para cargar diapositivas.
   Nota: El tejido mamario se utiliza aquí se preparó previamente de la Red de Biobancos Corea.

3. Preparación del tejido

1. Retire la parafina lado a otrom el tejido mediante la inmersión de diapositivas en 2x jarra Coplin en xileno fresco durante 10 minutos cada uno y rehidratar la sección de tejido por incubaciones de 5 min en concentraciones decrecientes de etanol (100%, 95% y 80%) en ddH ₂ O. Realice este paso en una campana de humos.
2. Sumergir el tejido en DEPC agua tratada durante 5 min. En este punto completar límites en torno sección de tejido con la pluma barrera hidrofóbica.
3. Fijar el tejido con 4% PFA durante 15 min seguido de un lavado con PBS.
4. Sumergir el tejido en 0,3% de Triton X-100 / PBS durante 10 min seguido de un lavado con PBS.
5. Incubar la muestra con una solución / l de proteinasa K 50 mg durante 15 minutos a 37 ° C. A continuación incubar las secciones de tejido con trietanolamina y anhídrido acético durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de un lavado con PBS. No se requiere un lavado con PBS entre el tratamiento con proteinasa K y / anhídrido acético tratamiento trietanolamina.

4. La hibridación

1. Lavar el tejido a fondo y incubate la sección de tejido con tampón de hibridación para 2-3 horas a temperatura ambiente. Típicamente 120 l de tampón de hibridación es suficiente para cubrir la sección de tejido.
2. Diluir 5'-DIG sonda marcada LNA a la concentración final de 3 horas, en la solución de hibridación 120 l. A medida que la concentración de reserva por lo general es de 40 ng / l, añadir 3 l de tampón de hibridación de valores para 120 l e incubar la mezcla a 95 ° C durante 5 min.
3. Incubar sección de tejido durante la noche con la sonda a 54 ° C (Tm) en una cámara húmeda. Típicamente 120 l es suficiente para cubrir una sección. Crear humedad mediante el uso de dos toallas de papel húmedo. El tamaño ideal de la cámara es de 10 pulgadas por 8 pulgadas.
4. Nota: Tm puede ser diferente para diferentes miARN. 54 ° C es la mención de miR-489.

5. rigurosidad de lavado

1. Lavar el tejido con 5 x SSC durante 7 minutos (después de la etapa de hibridación, RNasa condiciones libres ya no son necesarios).
2. Lavar la sección de tejido ingenioh 1x SSC durante 7 minutos dos veces a 57 ° C.
3. Lavar la sección de tejido con 0,2 x SSC durante 7 minutos a 57 ° C.
4. Lavar la sección de tejido con 0,2 x SSC durante 7 minutos a temperatura ambiente.
5. sección de tejido en PBS en incubación durante 10 min.

6. Bloqueo

1. Incubar la sección de tejido con tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hr en una cámara húmeda (Para hacer el amortiguador de bloqueo añadir 2 ml de FBS, 10 l de Tween-20 y 3 l de BSA en 18 m de PBS. Tienda tampón de bloqueo a 4 DO).

7. Anticuerpo primario Incubación y Desarrollo

1. Diluir 1: 300 de anticuerpo anti-DIG-AP en tampón de bloqueo y se incuba la sección de tejido con el anticuerpo a 4 ° C durante la noche.
2. Se lavan las secciones con tampón de lavado 3 veces, durante 5 minutos cada uno (tampón proporcionado por el kit de desarrollo).
3. Desarrollar la sección de tejido con un kit comercial para la fosfatasa alcalina que produce CY-3 luz fluorescente.
4. Lavar la sección con tampón de lavado durante 5 min. sección de la mancha con 100 l de 2,5 ng l de colorante / Hoechst durante 5 min seguido de un lavado de 5 min con tampón de lavado.
5. Montar la sección con tampón de montaje de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice 15 l por sección de tejido y limpie solución de montaje con el tejido excesivo limpie. Sellar la diapositiva con esmalte de uñas transparente para evitar fugas.
6. Observar al microscopio fluorescente usando la sección con un aumento de 10X lente de modo total es de 100X.

Resultados

Se utilizó el tejido de cáncer de mama humano para determinar la expresión de miRNA-489. Se encontraron conducto de la glándula mamaria y las células epiteliales de expresar significativamente más altos miARN-489 niveles que el tejido adyacente tumor en dos pacientes (Figura 1A y 1B). Esto demuestra claramente que la expresión de miRNA-489 se ha perdido en el tejido tumoral, lo que sugiere una actividad supresora de tumores de miARN-489. Para conf...

Discusión

El objetivo de este estudio fue determinar el nivel de expresión de los genes miARN en los tejidos de cáncer de mama utilizando miARN hibridación in situ. Hay que señalar que en este experimento, todas las condiciones se optimizaron para el tejido de cáncer de mama. Una optimización adicional puede ser necesario para otros tipos de tejidos. Todas las soluciones deben hacerse con agua DEPC y todos los contenedores que se utilicen deben ser enjuagados con agua tratada con DEPC y posteriormente en autoclave....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ELF-97	Life technology	E6604
50x Denhard't	Life technology	750018
t-RNA	Roche	109541	Reconstitute in DEPC water
Herring Sperm DNA	Promega	D1815
Roche Blocking	Roche	11096176001
RVC	Fisher	50-812-650	Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant
miR-489 probe	Exiqon	38599-01
Nuclease free BSA	Roche	711454
Primary antibody-anti DIG	Roche	11093274910
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	1609478