JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

Аннотация

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Введение

Рак молочной железы является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний, влияющих на женское население по всему земному шару. Более 1,3 миллиона случаев рака молочной железы сообщают каждый год по всему миру 1,2. Хотя опухолевые клетки традиционно считаются биологически гомогенным и высоко пролиферативные, стало очевидным, что рак молочной железы является генетически и клинически неоднородна. Устойчивость к распространенных противоопухолевых препаратов является отличительной чертой на поздних стадиях рака молочной железы, что приводит к смерти в большинстве пациентов через ее облегчения прогрессирования рака и метастазирования расстояния 3.

MicroRNAs (миРНК) представляют собой класс небольших молекул РНК примерно длиной 22 нуклеотидов , которые регулируют экспрессию генов путем блокирования трансляции мРНК или опосредовать деградацию мРНК 4. Более 2000 различных микроРНК до сих пор были идентифицированы у людей, которые связаны с заболеваниями человека 5. Увеличивается массив исследований ВГАе показали , что микроРНК может функционировать в качестве онкогенов и опухолевых супрессоров и часто дизрегуляции в опухолях 6. микроРНК сильно влияет на все первичные онкогенеза, контролируя основные регуляторы клеточного цикла, старении, апоптоза и аутофагии, наряду с таковыми из опухолевых клеток моторики, инвазию и метастазирование 7.

Выражение Аберрантная микроРНК было также связано с клиническими проявлениями , такими как стадия, дифференцировка, прогноза и ответа на адъювантной терапии 8. В частности, повышенная экспрессия микроРНК-146 коррелирует с плохим прогнозом при раке легкого пациентов 9. Другое исследование показало , что потеряли выражение микроРНК-let7b связана с злокачественными фенотипами и, как следствие, плохой выживаемости 6. Понимание типов клеток и структур, которые выражают микроРНК является важной частью понимания механики, через которые изменения в микроРНК выражение влияния клетки иткани фенотипы 10. Некоторые микроРНК найдены секретируется в стромальных клетках попадала в эпителиальных клетках и специфически воздействуют на их цели. В том же ключе, микроРНК-212 и микроРНК-132 секретируется стромы и регулировать эпителиальные-стромальных взаимодействий , необходимых для протоковой выроста в процессе развития молочной железы 11. Основная цель данной работы состоит в объяснении подробный протокол для выявления экспрессии микроРНК в тканях молочной железы с помощью микроРНК гибридизация. Мы оптимизировали все условия для анализа уровней экспрессии микроРНК-489 в образцах рака молочной железы пациента. С этой целью мы использовали DIG маркированы заперта кислоты (LNA) зонд нуклеиновой в нашем эксперименте. Некоторые из нуклеотидов имели модификацию МШУ, то есть, метиленовый мостик, соединяющий 2 'атом кислорода и 4' атом углерода рибозы основной цепи, которая фиксирует нуклеотид таким образом, что он остается "запертой на месте" после того, как гибридизации. В результате, это гораздо сложнеедля гибридизированных комплекс для денатурации 12,13.

протокол

Данное исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом из Чоннам больницы Университета Хвасун и Университета Южной Каролины. Образцы TMA, состоящие из рака молочной железы и совпавших соседних нормальных тканей молочной железы были предоставлены Биобанка из университета Чоннам больницы, член Корейской биобанке сети.

1. Получение раствора

  1. Готовят 1 л ДНКазы и РНКазы свободной воды. Сделать все химические растворы с использованием диэтилпирокарбонатом (DEPC) обработанной воды. Treat 1 л воды с 500 мкл DEPC и инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре. Автоклава водой инактивировать DEPC.
    Предостережение: Не вдыхать DEPC, так как известно канцерогеном.
  2. Приготовьте 1х PBS с 10-кратным PBS с использованием DEPC обработанной воды.
  3. Подготовка 20x SSC (растворять 175,3 г NaCl и 88,2 г цитрата натрия в 800 мл воды, довести рН до 7,0 с несколько капель 14 N раствора HCl и регулировать громкость до 1 л очистER), 4% параформальдегида, 95% этанола, 80% этанола с использованием DEPC очищенной воды.
  4. Добавить 8 мл триэтаноламина и 1,05 мл HCl в 590 мл ДЭФЦ обработанной воды и добавляют 1,5 мл уксусного ангидрида для ацетилирования.
  5. Подготовьте 50 мкг / мкл протеиназы К в буфере (50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, в DEPC очищенной воды).
  6. Подготовка буфера гибридизации, состоящий из 500 мкл формамида, 250 мкл 20x SSC, 100 мкл 50х раствора Денхардта, 12,5 мкл т-РНК, 2,5 мкл ДНК спермы сельди, 30 мкл РВК, 0,02 г блокирующими мкл реагента и 50 из DEPC воды. Подготовить свежие.

2. ткани молочной железы Разделы

  1. Вырезать 5 мкм фиксированных формалином погруженных в парафин секции с микротома и применять раздел для зарядки слайд 14.
    Примечание: ткани молочной железы, используемый здесь ранее получали из Кореи биобанке Network.

3. Подготовка ткани

  1. Удалить парафин сюдам ткани, погружая слайды в Коплин банку 2х в свежей ксилола в течение 10 минут каждый и регидратации срезы ткани на 5 мин инкубирования при уменьшении концентрации этанола (100%, 95% и 80%) в DDH 2 O. Выполните этот шаг в вытяжном шкафу.
  2. Погружают ткань в DEPC обработанной воды в течение 5 мин. На этом этапе сделать границы вокруг раздела тканей с гидрофобной барьерного пером.
  3. Закрепить ткань с 4% PFA в течение 15 мин с последующей промывкой ЗФР.
  4. Погружают ткань в 0,3% Triton X-100 / PBS в течение 10 мин с последующей промывкой PBS.
  5. Инкубируйте образца с 50 мкг раствора / мкл протеиназы К в течение 15 мин при 37 ° С. Затем инкубировать срезов ткани с триэтаноламина и уксусного ангидрида в течение 5 мин при комнатной температуре, с последующей промывкой ЗФР. Не мыть PBS не требуется между лечением протеиназы К и триэтаноламина обработки / уксусного ангидрида.

4. Гибридизация

  1. Промыть ткань тщательно и INCUBATE срез ткани с буфером для гибридизации в течение от 2 до 3 ч при комнатной температуре. Обычно 120 мкл буфера для гибридизации достаточно, чтобы покрыть ткань.
  2. Развести 5'-DIG меченый LNA зонд до конечной концентрации 3 мкМ в 120 мкл раствора для гибридизации. По мере того как концентрация запас обычно составляет 40 нг / мкл, добавляют 3 мкл запаса в 120 мкл буфера для гибридизации и инкубировать смеси при температуре 95 ° С в течение 5 мин.
  3. Выдержите участок ткани с зондом в течение ночи при 54 ° C (Tm) во влажной камере. Как правило, 120 мкл достаточно, чтобы покрыть одну секцию. Создание влажности с помощью двух влажных бумажных полотенец. Идеальный размер камеры составляет 10 дюймов на 8 дюймов.
  4. Примечание: Tm может отличаться для различных микроРНК. 54 ° C упоминание для MIR-489.

5. Жесткость Wash

  1. Промыть ткани с 5x SSC в течение 7 мин (после стадии гибридизации, РНКазы условия больше не требуется).
  2. Промыть срез ткани остроумиеч 1x SSC в течение 7 мин дважды при 57 ° C.
  3. Промыть срезы ткани с 0,2 × SSC в течение 7 мин при 57 ° C.
  4. Промыть срезы ткани с 0,2 × SSC в течение 7 мин при комнатной температуре.
  5. Инкубировать срезы ткани в PBS в течение 10 мин.

6. Блокирование

  1. Инкубировать срезы ткани с блокирующим буфером при комнатной температуре в течение 1 ч во влажной камере (Для того, чтобы блокирующий буфер добавляют 2 мл FBS, 10 мкл Tween-20 и 3 мкл БСА в 18 м от PBS. Хранить блокирующем буфере при 4 ° С).

7. Первичные антитела Инкубация и развития

  1. Разбавляют 1: 300 анти-DIG-AP антитела в блокирующем буфере и инкубировать срезы ткани с антителом при 4 ° С в течение ночи.
  2. Вымойте разделы с буфером для промывки 3 раза, в течение 5 мин каждый (буфер предоставляется комплект разработки).
  3. Разработка раздела тканей с помощью коммерческого набора для щелочной фосфатазы, который производит CY-3 флуоресцентный свет.
  4. Промыть участок с буфером для промывки в течение 5 мин. Пятно секция 100 мкл 2,5 нг / мкл Hoechst красителя в течение 5 мин, после чего 5 мин промывкой промывочным буфером.
  5. Установите секцию с монтажным буфера в соответствии с протоколом производителя. Используйте 15 мкл на срез ткани и вытрите избыточное решение монтажа с тканью салфеткой. Печать слайд с прозрачным лаком для ногтей, чтобы предотвратить утечку.
  6. Обратите внимание на раздел флуоресцентный микроскоп с помощью с 10-кратным объективом, так это общее увеличение 100X.

Результаты

ткани молочной железы человек был использован для определения экспрессии микроРНК-489. Были обнаружены молочной железы проток и эпителиальные клетки , чтобы выразить значительно более высокие микроРНК-489 уровней , чем соседние ткани опухоли у двух пациентов (рис 1А...

Обсуждение

Цель данного исследования состояла в том, чтобы определить уровень экспрессии микроРНК в тканях молочной железы с использованием микроРНК гибридизация. Следует отметить, что в этом эксперименте все условия были оптимизированы для ткани рака молочной железы. Дальнейшая оптимиза?...

Раскрытие информации

There is nothing to disclose.

Благодарности

This work was supported by the NIH grant (5R01 CA178386-03) and the USC ASPIRE-1 grant to HC. We would like to thank Vrushab Gowda for his assistance with manuscript.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ELF-97Life technology E6604
50x Denhard't Life technology 750018
t-RNARoche109541Reconstitute in DEPC water
Herring Sperm DNAPromega D1815
Roche Blocking Roche11096176001
RVCFisher50-812-650Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant 
miR-489 probe Exiqon38599-01
Nuclease free BSARoche 711454
Primary antibody-anti DIGRoche 11093274910
Diethyl Pyrocarbonate Sigma1609478

Ссылки

  1. Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
  2. Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
  3. Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
  4. Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
  5. McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
  6. Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
  7. Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
  8. Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
  9. Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
  10. Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
  11. Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
  12. Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
  13. Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
  14. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
  15. Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

112

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены