miRNA kullanarak Meme Kanseri Dokularındaki miRNA İfade Klinikopatolojik Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

Özet

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

Özet

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Giriş

Meme kanseri dünya genelinde kadın nüfusu etkileyen en yaygın maligniteler arasında yer alıyor. Meme kanseri 1.3 milyon vaka dünya çapında ^1,2 yılda bildirilmektedir. Tümör hücreleri, geleneksel biyolojik homojen ve yüksek proliferatif olarak kabul edilmiş olmasına rağmen, meme kanseri genetik ve klinik heterojen olduğunu belirgin hale gelmiştir. Yaygın antikanser ilaçlara direnç kanser ilerleme ve mesafe metastazı ³ onun kolaylaştırılması yoluyla hastaların çoğunluğunda mortaliteye neden ilerlemiş meme kanserlerinin bir özelliğidir.

MikroRNA'lar (miRNA'ların) mRNA translasyonunu bloke veya mRNA bozulmasını ⁴ aracılık gen ekspresyonunu düzenleyen yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda küçük RNA molekülleri sınıfıdır. 2.000 'den fazla farklı miRNA'lar kadar insan hastalıkları ⁵ ile bağlantılı olan, insanları tespit edilmiştir. çalışmalar artan bir dizi havE miRNA'lar onkojenlerin ve tümörleri giderici olarak işlev görebilir ve genellikle tümör ⁶ düzensiz olduğunu göstermiştir. miRNA'lar kuvvetle tümör hücre hareketi, invazyon ve metastaz ⁷ olanlarla birlikte hücre döngüsü ilerlemesinin, yaşlanma, apoptoz ve otofaji önemli regülatörleri kontrol ederek birincil tümörogenez tüm etkileyebilir.

Aberrant miRNA ifade aynı zamanda sahne, farklılaşma, prognozu ve adjuvan tedavi ⁸ yanıt olarak klinik etkileri ile ilişkili olmuştur. Özellikle, miR-146 ifadesi akciğer kanserli hastalarda ⁹ kötü prognoz ile ilişkilidir arttı. Başka bir çalışmada, miRNA let7b kayıp sentezleme Sonuç olarak, zayıf yaşama ^6, habis fenotipler ile bağlantılı ve göstermiştir. miRNA'lar ifade eden hücrelerin ve yapı türlerini anlamak olduğunu mekaniğini anlamak önemli bir parçası geçtiği miRNA ifade etkisi hücrede değişiklikler veDoku ¹⁰ fenotip. stromal hücrelerde salgılandığı bulunmuştur belirli miRNA'ların epitel hücreleri tarafından alınır ve özel olarak hedef doğrultusunda hareket edilir. Aynı şekilde, miR-212 ve miR-132 meme bezi gelişimi sırasında ¹¹ duktal büyümesi için gerekli epitel-stromal etkileşimleri stroma tarafından salgılanan ve regüle edilir. Bu çalışmanın genel amacı in situ hibridizasyon miRNA ile meme kanseri dokularında miRNA ifade algılamak için ayrıntılı bir protokol açıklamaktır. Biz meme kanseri hasta örneklerinde miRNA 489 ifadesinin seviyelerini analiz etmek için tüm şartları optimize ettik. Bu amaçla, işaretlenmiş DIG eden deneyde nükleik asit (LNA) prob kilitli kullanılır. Bunu nükleotid bazı, yani, bir LNA modifikasyonu sahip 2 ', oksijen atomu ve 4' de hibridizasyon sonrası "yerine kilitli" kalacak şekilde nükleotidi giderir riboz omurga karbon atomu bağlayan bir metilen köprüsü. Bunun bir sonucu olarak, çok daha zorhibridize kompleksi ^12,13 denatüre etmek için.

Protokol

Bu çalışma Kurumsal Gözden Chonnam Ulusal Üniversitesi Hwasun Hastanesi Yönetim Kurulu ve Güney Carolina Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Meme kanseri ve eşleşen bitişik normal meme doku oluşan TMA örnekleri Chonnam Ulusal Üniversitesi Hwasun Hastanesi, Kore Biobank Ağının bir üye Biobank tarafından temin edildi.

1. Solüsyon Hazırlama

1. DNaz ve RNaz içermeyen su 1 L hazırlayın. diethylpyrocarbonate (DEPC) arıtılmış su kullanan tüm kimyasal çözümler olun. DEPC 500 ul su ile 1 L tedavi ve oda sıcaklığında 3 saat inkübe edilir. DEPC inaktive su Otoklav.
   Dikkat: karsinojen bilindiğinden DEPC teneffüs etmeyin.
2. DEPC arıtılmış su kullanılarak 10x PBS 1x PBS hazırlayın.
3. 20x SSC (NaCl 175.3 g ve 800 ml su içinde sodyum sitrat 88.2 g çözülür hazırlanması HCI 14 N çözelti bir kaç damla 7.0 pH ayarlamak ve wat 1 L ses seviyesini ayarlamakER),% 4 paraformaldehit,% 95 etanol,% 80 etanol DEPC işlenmiş su ile.
4. 8 trietanolamin ilave edildi ve DEPC ile muamele edilmiş su 590 ml HCI 1.05 ml ilave edilir ve asetilasyonu için asetik anhidrid 1.5 ml ilave ediniz.
5. tampon maddesi içinde 50 ug / ml proteinaz K hazırlama (50 mM Tris-HCI, DEPC pH 8.0 su muamele edilmiş).
6. formamid 500 ul 20x SSC 250 ul, 50x Denhardt çözeltisi, 100 uL, t-RNA 12.5 ul, ringa sperm DNA'sı 2.5 ul, RVC 30 ul, bloke reaktif ve 50 ul 0.02 g oluşan hibridizasyon tamponu hazırlayın DEPC su. taze hazırlayın.

2. Meme Doku Bölümler

1. Mikrotom ile 5 mikron formalin ile fikse parafine gömülü bölümleri kesmek ve slayt ¹⁴ şarj etmek bölüm uygulayın.
   Not: Burada kullanılan meme dokusu Kore Biobank Network önceden hazırlanmıştır.

3. Doku Hazırlanması

1. fro parafin kaldır10 dakika boyunca, taze ksilen Coplin kavanoza 2x her bir slayt daldırarak doku m ve GKD ₂ O etanol (% 100,% 95 ve% 80) ve azalan konsantrasyonlarda 5 dakika inkubasyon doku bölümü rehidrasyonu Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin.
2. DEPC doku 5 dakika arıtılmış su bırakın. Bu noktada hidrofobik bariyer kalemle doku bölümünde etrafında sınırları yapmak.
3. PBS ile yıkama, ardından 15 dakika boyunca% 4 PFA doku çözmek.
4. PBS ile yıkama, ardından 10 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100 / PBS doku bırakın.
5. 37 ° C'de 15 dakika boyunca 50 ug / ml Proteinaz K çözeltisi ile örnek inkübe edin. Daha sonra PBS ile bir yıkama ve ardından, oda sıcaklığında 5 dakika için, trietanolamin ve asetik anhidrid ile doku bölümleri inkübe edin. Hiçbir PBS yıkama Proteinaz K tedavisi ve trietanolamin / asetik anhidrit tedavisi arasında gereklidir.

4. Melezleme

1. İyice ve incu doku yıkayınOda sıcaklığında 2 ila 3 saat için hibritleme tampon maddesi ile asitleme doku kesiti. Tipik 120 ul hibridizasyon tamponu doku bölümünü karşılamak için yeterli olduğunu.
2. Seyreltik 5'-DIG 120 ul hibridizasyon çözeltisi içinde 3 uM nihai konsantrasyona kadar LNA etiketlenmiş prob. stok konsantrasyonu genellikle 40 ng / | il olduğu için, 120 ul hibridizasyon tamponu stok 3 ul ilave et ve 5 dakika boyunca 95 ° C'de karışım inkübe edin.
3. nemli bir oda içinde 54 ° C'de (Tm) prob gece boyunca doku bölümü inkübe edin. Tipik 120 ul bir bölüm karşılamak için yeterlidir. İki ıslak kağıt havlu kullanılarak nem oluşturun. odasının ideal boyutu 8 inç 10 inç.
4. Not: Tm Farklı miRNA için farklı olabilir. 54 ° C miR-489 için söz olduğunu.

5. sıkılık yıkama

1. 7 dakika boyunca 5x SSC ile doku yıkayın (melezleme aşamasından sonra, RNaz ücretsiz koşullar artık gerekli vardır).
2. doku kesiti wit yıkayın57 ° C 'de iki kez 7 dakika süre ile H, 1x SSC.
3. 57 ° C 'de, 7 dakika için 0,2 X SSC ile doku kesiti yıkayın.
4. Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 0,2 X SSC ile doku kesiti yıkayın.
5. 10 dakika boyunca PBS içinde doku kesiti inkübe edin.

6. Engelleme

1. (Tampon PBS 18 m 2 mi FBS, Tween-20, 10 ul BSA 3 ul bloke yapmak için. Mağazası 4 ° C'de tampon bloke nemli bir oda içinde, 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke edici tampon ile doku kesiti inkübe ° C).

7. Birincil Antikor Kuluçka ve Kalkınma

1. bloke edici tampon içinde 300, anti-DIP-AP antikor ve gece boyunca 4 ° C 'de antikor ile doku kesiti inkübe: 1 seyreltin.
2. Her biri 5 dakika (geliştirme kiti tarafından sağlanan tampon maddesi) için, yıkama tamponu ile 3 kez bölümleri yıkayın.
3. CY-3 floresan ışık üretir alkalin fosfataz için bir ticari kit ile doku bölümü geliştirin.
4. 5 dakika boyunca yıkama tamponu ile bölüm yıkayın. Yıkama tamponu ile 5 dakika yıkama ve ardından, 5 dakika boyunca 2.5 ng / ml Hoechst boya, 100 ul Leke bölümü.
5. üreticinin protokolüne göre bir tampon montaj bölümüne monte edin. Doku Bölüm başına 15 ul kullanın ve doku ile aşırı montaj çözümü silin silin. sızıntı önlemek için şeffaf tırnak cilası ile slayt mühür.
6. 10X objektif yani toplam büyütme kullanarak bölüm floresan mikroskop gözlemleyin 100X olduğunu.

Sonuçlar

İnsan göğüs kanseri dokusu miRNA 489 ekspresyonunu belirlemek için kullanılmıştır. Meme bezi kanalı ve epitel hücreler bitişik iki hastada tümör dokusunda (Şekil 1A ve 1B) önemli ölçüde daha yüksek MiRNA-489 seviyelerini ifade bulunmuştur. Bu açıkça miRNA 489 ifadesi miRNA 489 tümör baskılayıcı aktivite düşündüren, tümör dokusunda kayıp olduğunu göstermektedir. daha da aynı hastadan alınan, bu sonuçlar, tümör do...

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, in situ hibridizasyon miRNA kullanarak meme kanseri dokularında MiRNA ekspresyon seviyesini belirlemek için yapıldı. Deneyde, tüm koşullar meme kanseri dokusu için optimize olduğu not edilmelidir. Ayrıntılı optimizasyon diğer doku tipleri için gerekli olabilir. Bütün çözeltiler DEPC su ile yapılmalıdır ve kaplar DEPC işlenmiş, su ile durulandı ve daha sonra otoklavlanmalıdır kullanılır. Hatta hafif RNaz kirlenme deney nihai sonucu etkileyebilir. MiRNA çok k?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ELF-97	Life technology	E6604
50x Denhard't	Life technology	750018
t-RNA	Roche	109541	Reconstitute in DEPC water
Herring Sperm DNA	Promega	D1815
Roche Blocking	Roche	11096176001
RVC	Fisher	50-812-650	Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant
miR-489 probe	Exiqon	38599-01
Nuclease free BSA	Roche	711454
Primary antibody-anti DIG	Roche	11093274910
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	1609478