miRNA의를 사용하여 유방암 조직에서의 miRNA 발현의 임상 병리학 적 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

요약

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

초록

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

서문

유방암은 전세계 여성 인구에 영향을 미치는 가장 흔한 악성 종양 중 하나입니다. 유방암의 130 만 이상의 경우는 전 세계적으로 ^{1, 2} 매년보고됩니다. 종양 세포 전통적 생물학적 균질 높은 증식으로 간주되었지만, 유방암 유전자 임상 이질적인 것을 분명하게 하였다. 유행 항암제에 대한 내성은 암의 진행과 전이 거리 ^(3)의 촉진을 통해 대부분의 환자에서 사망에 이르는 고급 유방암의 특징이다.

마이크로 RNA (miRNA가)의 mRNA의 번역을 차단하거나 mRNA의 분해 ^{4 중개하여} 유전자 발현을 조절하는 약 22 개의 뉴클레오티드 작은 RNA 분자 클래스이다. 2,000 개 이상의 다른의 miRNAs 지금까지 인간의 질병 ^(5)에 연결되어 인간에서 발견되었습니다. 연구의 증가 배열은 근래전자는의 miRNAs는 종양 유전자와 종양 억제 기능을 할 수 종종 종양 ⁶ 조절 곤란 것을 보여 주었다. miRNAs는 강하게 종양 세포 운동성, 침윤 및 전이 ^(7)의 것들과 함께, 세포주기 진행, 노화, 세포 사멸 및 자식 작용의 주요 레귤레이터를 제어하여 일차 종양 모두 영향을 미친다.

비정상적인 miRNA의 발현은 또한 무대, 분화, 예후 및 보조 요법 ^(8)에 대한 응답으로 임상 적 의미와 연결되었습니다. 특히 미르-146의 발현은 폐암 환자 ^9의 불량한 예후와 관련되어 증가 하였다. 또 다른 연구의 miRNA-let7b의 손실 발현이 결과적으로 가난한 생존 ^6, 악성 표현형에 연결되어 있음을 보여 주었다. miRNAs의 발현이 세포 구조의 유형을 이해하는 것은 메커니즘을 이해하는데 중요한 부분되는 miRNA의 발현에 영향을 미치는 셀 변경 및조직은 ¹⁰ 표현형. 간질 세포에서 분비되는 것으로 밝혀 특정 miRNAs의 상피 세포에서 찍은 구​​체적 목표물에 작용한다. 같은 맥락에서 미르-212은 miR-132는 유선 개발 ^11시 유관 가지에 필요한 상피 세포 - 기질 상호 작용을 기질에 의해 분비와 조절된다. 이 논문의 전반적인 목적은 계내 혼성화에 miRNA를 통해 유방암 조직에서의 miRNA 발현을 검출하는 상세한 프로토콜을 설명하는 것이다. 우리는 유방암 환자 샘플에서의 miRNA-489의 발현 수준을 분석하기 위해 모든 조건을 최적화했다. 이를 위해, 우리는 표시된 DIG는 우리의 실험에서 핵산 (LNA) 프로브를 고정 사용. 그 뉴클레오티드의 일부, 즉,는 LNA 수정 있던 2 '산소 원자 및 4'는 혼성화 후 "의 위치에 고정"상태로 유지되도록 염기를 해결 리보스 골격의 탄소 원자를 연결하는 메틸렌 다리. 그 결과, 훨씬 더 어렵다혼성화 단지는 ^{12, 13를} 변성하기 위해.

프로토콜

본 연구는 기관 검토 전남 대학교 화순 병원의 이사회와 사우스 캐롤라이나 대학의 승인을 받았다. 유방암과 일치 인접 정상 유방 조직 구성 TMA 샘플은 전남 대학교 화순 병원, 한국 바이오 뱅크 네트워크의 회원의 바이오 뱅크가 제공되었다.

1. 솔루션 준비

1. DNase의와의 RNase 무료 물 1 L를 준비합니다. 디 에틸 피로 카보 (DEPC) 처리 된 물을 사용하는 모든 화학 솔루션을합니다. DEPC 500 μL에 물 1 L를 처리하고, 실온에서 3 시간 동안 배양한다. DEPC을 비활성화하는 물을 압력솥.
   주의 :이 발암 물질 알려져 있기 때문에 DEPC를 흡입하지 마십시오.
2. DEPC 처리 된 물을 사용하여 10 배 PBS에서 1X PBS를 준비합니다.
3. , 20 배 SSC (염화나트륨의 175.3 g 및 800 ml의 물에 구연산 나트륨의 88.2 g을 용해 준비의 HCl (14) N 용액 몇 방울 7.0 pH를 조정하고 와트 1 L에 볼륨을 조정ER), 4 % 파라 포름 알데히드, 95 % 에탄올, 80 % 에탄올 DEPC 처리 된 물을 사용.
4. 8 트리에탄올 아민 ㎖의 DEPC 처리 된 물 590 ㎖ 중의 염산의 1.05 ML을 추가 및 아세틸 화를 위해 무수 초산 1.5 ml에 추가 할 수 있습니다.
5. 버퍼에 50 μg의 / ㎕의 단백질 분해 효소 K를 준비 (50 mM 트리스 - 염산은 DEPC의 pH가 8.0 물 처리).
6. 포름 아미드 500 μL, 20 배 SSC 250 μL, 50 배 덴 하르트 용액 100 μL, t-RNA의 12.5 μL, 청어 정자 DNA의 2.5 μL, RVC 30 μL, 차단 시약 50 μl를 0.02 g로 구성된 하이브리드 버퍼를 준비 DEPC 물. 신선한 준비합니다.

2. 유방 조직 섹션

1. 마이크로톰으로 5 μm의 포르말린 고정 파라핀 포함 된 부분을 잘라 슬라이드 ^(14)를 충전 할 수있는 부분을 적용합니다.
   참고 : 여기에 사용되는 유방 조직이 한국 바이오 뱅크 네트워크에서 이전에 제조 하였다.

3. 조직 준비

1. 이리저리 파라핀을 제거10 분 동안 신선한 크실렌 코 플린 항아리 배에 각각 슬라이드 침지하여 조직에서 m DDH ₂ O. 에탄올 (100 %, 95 % 및 80 %)의 농도를 감소시키는 5 분간 배양하여 조직 절편을 재수 흄 후드에서이 단계를 수행합니다.
2. DEPC의 조직이 5 분 동안 물을 처리 빠져. 이 시점에서 소수성 장벽 펜으로 조직 섹션 주변에 경계를 확인합니다.
3. PBS로 세척 한 다음 15 분 동안 4 % PFA와 조직을 수정합니다.
4. PBS로 세척 한 다음 10 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100 / PBS에서 조직을 담근다.
5. 37 ° C에서 15 분 50 μg의 / μL 테 K 용액으로 샘플을 품어. 그 다음 PBS로 세척 한 다음 실온에서 5 분 동안 아민 및 아세트산 무수물과 조직 절편을 배양한다. 어떤 PBS 세척은 테 K 처리 및 트리에탄올 아민 / 무수 초산 처리 사이에 필요하지 않습니다.

4. 하이브리드

1. 철저하게 인큐 조직을 씻으십시오실온에서 2 시간 내지 3에 대한 혼성화 완충액 BATE 조직 절편. 일반적으로 120 ㎕의 혼성화 완충액을 조직 절편을 커버하기에 충분하다.
2. 희석 5'-DIG 120 ㎕의 하이브리드 솔루션 오후 3시의 최종 농도 LNA 프로브를 표시. 재고 농도는 통상 40 NG / μL 바와 같이, 120 ㎕의 혼성화 버퍼 스톡 3 μL를 추가 5 분 동안 95 ℃에서 혼합물을 배양한다.
3. 습기 챔버에서 54 ° C (TM)에서 프로브 밤새과 조직 섹션을 품어. 일반적으로 120 μl의 한 부분을 커버하기에 충분하다. 이 젖은 종이 타월을 사용하여 습도를 만듭니다. 챔버의 이상적인 크기는 8인치 10 인치입니다.
4. 참고 : Tm은 다른 miRNA의 다를 수 있습니다. 54 ° C 미르-489에 대한 언급이다.

5. 엄격도 세척

1. 7 분 동안 5 배 SSC와 조직을 씻으 (하이브리드 단계 이후에,의 RNase 무료 조건이 더 이상 필요 없음).
2. 조직 섹션 위트을 씻으십시오57 ° C에서 두 번 7 분 시간 1X SSC.
3. 57 ° C에서 7 분 동안 0.2 배씩 SSC와 조직 섹션을 씻으십시오.
4. 실온에서 7 분 동안 0.2 배씩 SSC와 조직 섹션을 씻으십시오.
5. 10 분 동안 PBS에서 조직 섹션을 품어.

6. 차단

1. (완충액 PBS의 18m 2 ML의 FBS, 트윈 -20 10 μL 및 BSA 3 μL를 추가 차단 확인하십시오. 스토어 4에서 블로킹 완충액 습한 챔버에서 실온에서 1 시간 동안 블로킹 완충액으로 조직 절편을 부화 기음).

7. 차 항체 배양 및 개발

1. 버퍼를 차단 300 항 DIG-AP 항체와 하룻밤 4 ° C에서 항체와 조직 섹션을 품어 : 1 희석.
2. 5 분마다 (개발 키트에서 제공하는 버퍼)에 대해, 세척 버퍼로 3 번 섹션을 씻으십시오.
3. CY-3 형광 빛을 생성하는 알칼리 포스 파타 아제에 대한 상용 키트와 함께 조직 섹션을 개발한다.
<리는> 5 분 동안 세척 버퍼 섹션을 씻으십시오. 세척 완충액으로 5 분 세척 한 다음 5 분 동안 2.5 NG / μL의 Hoechst 염료 100 ㎕와 얼룩 부분.
4. 제조 업체의 프로토콜에 따라 버퍼를 장착와 섹션을 탑재합니다. 조직 섹션 당 15 μl를 사용하여 조직과 과도한 장착 솔루션을 닦아 닦아냅니다. 누출 방지하기 위해 명확한 매니큐어와 슬라이드를 밀봉합니다.
5. 10X 렌즈 그래서 총 배율 사용하여 섹션 형광 현미경을 관찰 100X입니다.

결과

인간 유방암 조직의 miRNA-489은 발현을 측정 하였다. 유선 관 상피 세포는 인접한 두 환자에서 종양 조직 (도 1A 및 1B)에 비해 상당히 높은 수준의 miRNA-489를 발현하는 것으로 하였다. 이것은 분명히의 miRNA-489 발현의 miRNA-489 종양 억제 활성을 시사 종양 조직 소실 한 것을 보여준다. 또한 같은 환자에서 이러한 결과, 종양 조직과 인접한 정상 조직을 ?...

토론

이 연구의 목적은 현장에서 miRNA의 혼성화를 사용하여 유방암 조직에서의 miRNA 발현 수준을 결정 하였다. 본 실험에서 모든 조건 유방암 조직에 최적화 된 것을 유의하여야한다. 또한 최적화는 다른 조직 유형에 필요한 될 수 있습니다. 모든 솔루션은 DEPC 물로 만든되어야하며, 모든 컨테이너는 DEPC 처리 수로 세척하고이어서 멸균해야 사용할 수 있습니다. 비록 약간의 오염 된 RNase 실험의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ELF-97	Life technology	E6604
50x Denhard't	Life technology	750018
t-RNA	Roche	109541	Reconstitute in DEPC water
Herring Sperm DNA	Promega	D1815
Roche Blocking	Roche	11096176001
RVC	Fisher	50-812-650	Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant
miR-489 probe	Exiqon	38599-01
Nuclease free BSA	Roche	711454
Primary antibody-anti DIG	Roche	11093274910
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	1609478