TAPE:一种生物可降解止血胶由无处不在的复方植物外科应用的启发

摘要

我们描述制备生物可降解医用胶，有一个有效的止血能力的最简单的协议。带通过单宁酸的混合制备的水不混溶的超分子聚集体，一个无处不化合物在植物中发现，和聚（乙烯）乙二醇，与商业纤维蛋白胶相比，得到一个2.5倍的耐水附着性。

摘要

此视频描述了制备可生物降解的手术胶水具有比商业组织粘合剂的有效的止血能力和更大的耐水粘合强度的最简单的协议。医用粘合剂已经由于其在使用方便与微创备受关注的潜在的替代工具，缝线和U形钉。虽然有几种协议制定组织粘合剂包括那些市售如纤维蛋白胶水和氰基丙烯酸酯基材料，主要是它们需要一系列的有机分子，或复杂的蛋白质纯化方法的化学合成的，在生物驱动材料的情况下（ 即纤维蛋白胶）。此外，手术胶水的发展显示出高的粘合性，同时维持生物降解性仍然是一个挑战，因为在实现本体的潮湿环境良好的性能的困难。我们说明了一种新的方法来准备医用胶，称为胶带，由植物来源的，湿耐粘合剂分子的物理混合后形成的水不混溶性的超分子聚集体的重量为基础的分离，T annic 的 CID（TA），以及公知的生物聚合物，聚（乙烯）乙二醇（PEG）。随着我们的做法，录像显示粘接强度高，比在有水存在的商业纤维蛋白胶的2.5倍。此外，磁带是在生理条件下可生物降解的，并且可以用作抗组织出血一种有效的止血胶水。我们预期在各种医疗环境和药物递送的应用中，广泛使用磁带的诸如用于粘膜粘附更为聚合物，药物贮藏和。

引言

在过去的十年中，已经进行了努力，以取代目前的手术缝合线和缝合钉关闭与生物可降解/生物可吸收的粘合剂伤口由于在外科手术处理它们在使用和低组织侵袭性的便利。市售的组织粘合剂分为四种类型:（1）氰基丙烯酸酯衍生物^1，（2）通过酶转化从纤维蛋白原形成由凝血酶^2,3至纤维蛋白聚合物的血纤维蛋白胶，（3）基于蛋白质的材料，如化学或物理交联的白蛋白和/或明胶^4,5，和（4）为基础的聚合物合成的^6。尽管它们已经在许多临床应用中使用，所有的粘合剂具有其自己固有的不足和缺陷，可以是它们的广泛使用的障碍。氰基丙烯酸酯系胶粘剂显示出高的粘合强度的组织，但它们的毒性副产物如氰基和甲醛降解过程中形成的，常会导致符号量占用度的炎症反应^7。血纤维蛋白胶水和白蛋白或明胶基材料具有关于传染性成分，如动物来源的病毒的传输安全性的问题:人血浆纤维蛋白胶水和动物包括牛，鸡，猪和鱼明胶基胶水^8。虽然一些基于合成聚合物的粘合剂已通过美国联邦药物管理局（FDA），由合成聚合物的大多数粘合剂继续在减少制造过程中的步骤和实现生物相容性⁹困难。最重要的是，所有的胶水贫困机械和粘接强度遭受湿纸巾^10。近日，由贻贝^11-13，14壁虎，壁虎与贻贝¹⁵和内寄生蠕虫启发¹⁶仿生组织粘合剂已经逐渐成为有前途的替代品，以目前的医疗胶由于其可调的机械和粘接性能与生物相容性。然而，到了今天，仍有待解决的问题，他们成为商业化产品^17日之前。

在这里，我们报告一个称为胶带全新型医疗胶是由植物来源的粘附分子，单宁酸（TA）和一个生物惰性聚合物聚（乙二醇）（PEG）之间的分子间氢键制备正如其名称所示。 TA是植物的次生代谢过程中发现普遍存在的代表水解单宁。它已引起人们的关注，因为它的抗氧化剂，抗诱变，和抗致癌特性，并已被证明参与超分子相互作用与许多聚合物，如聚（N- -isopropylacrylamide）（PNIPAM）和聚（N -乙烯基吡咯烷酮）（PVPON），以形成层-层（LBL）膜^18-20和药物释放的微胶囊^21-23。在这项研究中，我们发现，TA可以作为一个有效的行动耐水粘接性官能基团，以形成医用粘合剂，胶带。通过用TA简单混合，非结垢聚合物PEG变得与超分子胶2.5倍与商业纤维蛋白胶相比增加粘合强度，并且此粘附保持在整个装卸的多达20个循环，甚至在水存在。其止血能力上的肝出血模型的体内测试，并显示出良好的止血能力以停止在几秒钟内出血。录像带的相关领域作为第一植物性粘合剂可以揭示新的洞察解决与生物启发方法目前存在的问题的弊端其显著的意义。我们也期望在各种医疗和药物应用如粘膜粘合剂，药物释放的补丁，伤口护理敷料以及其他的广泛使用磁带，由于其制备方法简单，可扩展性，可调谐的生物降解速率，以及高湿耐adhes离子的特性。

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研究方案

所有的动物护理和实验是按照由KAIST（科学与韩国高等科技学院）提供的道德协议IRB（伦理审查委员会）执行。

1. TAPE形成

1. 制备的TA溶液，放置在磁力搅拌器上4ml的大小的玻璃小瓶中，并加入1毫升蒸馏水有搅拌棒。 1克鞣酸加入到小瓶中，并通过温和搅拌以200rpm以上1小时溶解在水中。当TA完全溶解，该混合物变成透明的褐色。
2. 通过由涡旋几秒到使白色浆液将它们混合加入1g的PEG粉末（4-臂，10 kDa的，以及直链的，4.6 kDa的）至1毫升蒸馏水，随后制备的PEG溶液。保持在孵化该浆料在60℃下10分钟。直到白某变得完全清楚。
   注:PEG的10 kDa的分子量的熔点为约55- 60℃，并在4 kDa的一个是53 - 58℃。熔化的PEG变成水混溶性，使得PEG的水高达1克高浓度/毫升，可以实现为透明的溶液。一旦明确PEG溶液在高温下形成的，该溶液仍然是冷却后在室温下是稳定的。
3. 添加PEG的329微升（4-臂，10 kDa）的溶液中制备1.2至671微升在步骤1.1中制备的TA溶液（在具有4.6 kDa的线性PEG的情况下，添加的PEG溶液的311微升至689微升在微型离心管中的TA溶液）。轻轻地融合与一个狭窄的铲两粘性和蜂蜜般的解决方案，它们均匀混合。
   注意:这两种解决方案都相当粘稠，所以科学家必须缓慢而充分地拉起来 ​​，用微量的传输解决方案。
4. 旋在12300 xg离心在装有固定角转子的离心分离机，在步骤1.3制备3分钟的混合物。
5. 仔细REM奥雅纳尽可能多使用微量上清液尽可能的，并收集已定下来的产品是:这是完全形成胶带。后胶带的形成，它存放在冰箱（4 - 8℃）长达数周。注 :TAPE能够用γ射线或在外科应用在使用前的电子束处理来灭菌。

2.带粘合强度的测量

1. 制备猪皮肤组织的两片由在皮肤上的组织去除所有脂肪后，用活检穿孔切割直径为6毫米。
   注:从健康猪侧翼的皮肤得到的猪皮肤组织，并从位于大田的韩国当地肉类市场购买。
2. 适用的商业氰基丙烯酸酯胶的每个组织的外侧，并且组织附着到金属杆。
   注:金属杆被用作补充手柄，使织物a重不直接由机器夹住。因此，它可以用下面的拉伸机的结构的其他材料来代替。
3. 应用带的压降（TAPE一滴大约为3 - 6毫克）于组织的一侧。然后，散布在胶带均匀地使用在其内两侧的两个组织之间的另一个组织，以便它们所连接， 如图2A所示 。
4. 然后，手动附加和分离组织双方几次混匀并最大限度地提高各组织和磁带之间的接口。
5. 用UTM，小心地夹住杆的每一侧。的粘接强度将通过分离附着有胶带两种组织所需的力来确定。首先，应用的20 N的力1分钟。接着，用机，以1mm /分的速度拉在相反方向上各棒。直至组织完全分离。
   注意:数据将给出的力-距离由运动检测（FD）曲线的每个杆。
6. 除以在步骤2.5通过样品表面区域取得的FD曲线所示的最大力（kN）计算带的粘合强度，也就是3.14×（0.003米^）2。
7. 对于在水的存在下监测的粘接强度，加入20微升的水在分离的区域两种组织之间，并立即附加它们。随着机，再次进行测试支队。

3. 体外降解测试

1. 切微型离心管的盖子（D = 8 MM），并权衡帽将其定义为W _C。
2. 装满150毫克磁带的帽子，再权衡所有一起将其设置为一个总的初始重量W _0。
   注意:不要在帽超载TAPE。带的高度应该比盖的顶部低，因为它可以是一个物理屏障以在步骤3.4中孵育期间由搅拌过程中产生的PBS缓冲液的流。
3. 把含有TAPE到细胞培养瓶的帽（75 ^平方厘米），并加入50毫升的PBS缓冲液（1×，pH 7.4）中，以细胞培养烧瓶，以便在盖的磁带完全浸入PBS缓冲液，如在图3A所示（N = 5）。
4. 孵育在步骤3.3中，在37℃，类似于生理条件的轨道摇动孵化器中制备的细胞培养瓶中，在温和搅拌下（50rpm）进行。
   注意:保持搅拌条件以50rpm。更高的转速可能导致TAPE的崩溃。
5. 在每个时间点，采取与从细胞培养烧瓶TAPE帽，然后通过吹氮气干燥。称量装有剩余磁带上限。在每个时间点为W _t将重量。再次更换新鲜的PBS，并在每个时间点测量W¯¯ _吨后再次摇晃。
6. 计算相对其余重量（％）在下面的等式。
   相对剩余重量（％）=（W _吨 - W _{C）/（W 0} - W _C）×100％

4.带止血能力

注:所有的动物实验应按照卫生和福利部韩国提供的准则和道德协议来完成。

1. 为了评估在体内的止血功能，如参考文献²⁴中描述审查出血鼠肝模型。
2. 麻醉15只小鼠（正常ICR小鼠，6周，30 - 35克，雄性）以替来他明 - 唑拉西泮（33.333毫克/千克）和赛拉嗪（7.773毫克/千克）的腹膜内注射（N =每组5只）。要确认正确的麻醉，轻轻一捏动物的爪子和观察运动，如抽出爪子等 ，没有动作表明，该动物是充分麻醉做手术。
3. 为防止动物的眼睛干涩，下充分而申请的兽医药膏眼睛感知。暴露经由中线腹部切口肝脏，并用18G的针以诱导出血刺肝脏。
4. 除去流动的血液用无菌纱布，并把100微升TAPE或纤维蛋白胶（阳性对照）的立即在出血部位。
   注:在应用胶带后，需要因对伤口组织中的高血耐粘接性能没有进一步的缝合。为阴性对照，无处理发生在出血的部位。
5. 在每一种情况下，把一个滤纸与已知质量的肝脏下方，以收集来自损伤部位的血液。用新的，每30秒，4次（ 即 ，2分钟）更换纸张。
6. 测量所收集的每30秒每滤纸吸收血液的质量。动物实验后，通过牺牲_二氧化碳窒息安乐死的老鼠。

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结果

带是超分子聚集体离心含有TA（1微克/毫升蒸馏水中）和PEG（1微克/毫升的蒸馏水中）与2两种水溶液的混合物后稳定下来:1的体积比（ 图1A）。混合比是在实现高粘附强度的关键因素;当带通过一个2形成的:1混合比，20个单位在25个单位的TA的羟基（-OH）的与PEG各醚基（-O-）相互作用，导致最高的分子间氢键形成具有最大粘附性能。 -OH的其余五个单位似乎通过与TA?...

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讨论

我们开发了一个全新的由植物衍生的多酚化合物，TA的抗水分子相互作用的启发止血胶粘剂命名的胶带。 TA是一个代表可水解单宁已显著受到关注，因为它的抗氧化，抗菌，抗诱变，和抗致癌特性。

使磁带的过程是非常简单的，可扩展和环境友好的，因为它仅仅是两种水溶液随后不经任何进一步的化学合成方法离心的一步法混合。

双组分混合协议是形成?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tannic acid	Sigma-aldrich	403040
Poly(ethylene oxide), 4-arm, hydroxy terminated	Aldrich	565709	Averge Mn ~ 10,000
Poly(ethylene glycol)	Aldrich	373001	Average Mn 4,600
Biopsy punch	Miltex	33-36	Diameter = 6 mm
Aron Alpha	Toagosei Co., Ltd.		Instant glue
Universal testing machine (UTM)	Instron	5583
Microcentrifuge tubes	SPL life science	60015	1.5 ml
Petri dish	SPL life science	10090	90 x 15 mm
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	1x PBS ingredient
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S5136	1x PBS ingredient
Sodium chloride	Duchefa biochemie	S0520.5000	1x PBS ingredient
Incubating shaker	Lab companion	SIF6000R
ICR mice	Orient bio	Normal ICR mouse	6 weeks, 30 - 35 g, male
Tiletamine-zolazepam (Zoletil 50)	Virbac
Zylazine (Rompun)	Bayer
PrecisionGlideTM needle (18 G)	BD	302032	18 G
Filter paper	Whatman	1001 125	Diameter = 125 mm
Parafilm	Bemis Flexible Pakaging	PM996