TAPE : 외과 응용 프로그램에 대한 식물의 유비쿼터스 화합물에서 영감을 생분해 성 지혈 접착제

요약

우리는 효과적인 지혈 기능을 갖는 의료용 생분해 성 접착제를 제조하는 가장 간단한 프로토콜을 설명한다. 테이프 탄닌산 혼합 한 물 - 비혼 화성 초분자 집합체 인 상업용 피브린 접착제에 비해 2.5 배 더 내수성 접착 성을 수득하는 유비쿼터스 화합물은 식물에서 발견 한 폴리 (에틸렌) 글리콜.

초록

이 동영상은 상업 조직 접착제보다 효과적인 지혈 능력과 큰 방수 접착 강도가 생분해 성 수술 용 접착제를 제조하기위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 의료 접착제로 인해 최소한의 침입과 사용에서의 편리 성을 봉합하고 스테이플에 대한 잠재적 인 대안 도구로 큰 관심을 받고있다. 생체 기반 물질의 경우와 같은 피브린 접착제 및 시아 노 아크릴 레이트 계 재료 등의 시판 사람들은 대부분들은 유기 분자 나 복잡한 단백질 정제 방법의 화학 합성의 일련의 요구를 포함한 조직 접착제를 개발하기위한 몇 가지 프로토콜이 있지만 (즉, 피브린 접착제). 또한, 외과 용 접착제의 개발이 생분해 성을 유지하기 때문에 인체의 습윤 환경에서 양호한 성능을 달성하는데 어려움이 여전히 도전하면서 높은 접착 성을 나타내는. 우리는을 준비하는 새로운 방법을 설명식물 유래 습식 강한 접착 분자의 물리적 혼합 한 후, 형성 물 혼화 초분자 집합체의 중량을 기반으로 분리하여, TAPE라고도 의료 접착제, T는 CID (TA), 및 잘 알려진 annic 생체 고분자, 폴리 (에틸렌) 글리콜 (PEG). 우리의 접근 방법으로, TAPE는 물의 존재 상용 피브린 접착제보다 2.5 배 높은 접착 강도를 나타낸다. 또한, TAPE는 생리 학적 조건에서 생분해 성 및 조직의 출혈에 대하여 강력한 지혈 접착제로서 사용될 수있다. 우리는 뮤코 접착 중합체, 약물 저장소 등과 같은 의료 설정 및 약물 전달 다양한 애플리케이션에서 테이프의 광범위한 사용을 예상한다.

서문

과거 10 년의 노력으로 인해 수술 적 치료시 사용과 낮은 조직 침입에 자신의 편의에 생분해 성 / 흡수성 접착제와 상처를 닫 현재 수술 봉합 및 스테이플을 교체되었습니다. 시판 조직 접착제는 네 가지 유형으로 분류된다 : (1) 시아 노 아크릴 레이트 유도체 ⁽¹⁾ (2) ^{2,3- 트롬빈에} 의해 중합체를 피브린, 피브리노겐으로부터 효소 적 전환에 의해 형성된 피브린 접착제를, (3) 등의 화학적 또는 물리적으로 같은 단백질 계 재료 가교 알부민 및 / 또는 젤라틴 ^4.5, (4) 합성 폴리머 계 것 ^6. 그들은 많은 임상 용도에 사용되어 왔지만, 모두 접착제는 자신 고유의 단점들이 널리 사용 장애물이 될 수있는 단점이있다. 시아 노 아크릴 레이트 계 접착제는 조직에 대한 높은 접착 강도를 보여 주지만, 이들 독성 부산물 등의 분해 동안 형성 및 시아 노 포름 종종 부호 원인염증 반응 ^(7)의 ificant도. 젤라틴 기반의 접착제 ⁸ 소, 닭, 돼지, 물고기를 포함하여 피브린 접착제과 동물에 대한 인간의 혈장 : 피브린 접착제 및 알부민 또는 젤라틴 기반 물질은 동물의 소스에서 바이러스와 같은 감염 구성 요소의 전송에 대한 안전 문제가 있습니다. 약간의 합성수지 계 접착제 연방 의약품 안전청 (FDA)에 의해 승인되었지만, 합성 중합체로 만들어진 대부분의 접착제는 제조 공정 단계를 최소화하고 생체 적합성 ^(9)을 달성하는데 어려움을 계속한다. 가장 중요한 것은, 모든 접착제는 물티슈 ¹⁰ 가난한 기계 및 접착 강도 고통. 최근 해양 홍합 ^11-13, 도마뱀 붙이 ^(14), 홍합 ¹⁵ 도마뱀, 그리고 endoparasitic 웜 ^(16)에 의해 영감을 생체 모방 조직 접착제는 그들의 조정 가능한 기계적으로 현재 의료 접착제에 관한 유망한 대안을 신흥되었습니다생체 적합성과 접착 특성. 그들은 상용 제품 ^(17)되기 전에 그러나, 오늘날까지 여전히 해결해야 할 문제가 있습니다.

여기서는, 식물 유래 접착 분자, 탄닌산 (TA), 및 생체 불활성 중합체 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)의 분자간 수소 결합에 의해 제조 TAPE라는 의료용 접착제 완전히 새로운 유형을보고 그 이름에서 알 수 있듯이. TA는 보편적으로 식물의 2 차 대사 중에 발견 대표 가수 분해성 탄닌이다. 또한, 항 돌연변이 및 항암 성질 인하여 항산화에 많은 주목을 받고 있으며, 폴리 (N의 이소 프로필 아크릴 아미드) (PNIPAM) 및 폴리 (N만큼 중합체와 초분자 상호 작용에 참여하는 것으로 나타났다 - 비닐 피 롤리 돈) (PVPON), 계층별로 레이어 (LBL) 영화 ^{18 ~ 20} 약물 방출 마이크로 캡슐 ^{21 ~ 23을} 형성한다. 본 연구에서는 TA 효율적인 역할을 할 수 있음을 발견방수 접착제 관능기 테이프, 의료 접착제를 형성한다. TA 간단한 혼합하여, 비 오염 중합체 PEG를 갖는 초분자 접착제하게 2.5 배 상업적 피브린 접착제에 비하여 증가 된 접착 강도를,이 밀착성에도 물의 존재 하에서, 착탈의 최대 20주기 동안 유지시켰다 . 그 지혈 능력은 생체 내에서 간 출혈 모델을 테스트하고 몇 초 내에 출혈을 멈추게하는 좋은 지혈 능력을 보여 주었다. TAPE 바이오 영감 접근 방식과 현재 문제의 단점을 해결에 새로운 통찰력을 공개 할 수있는 최초의 식물 유래 접착제로서 관련 분야에서의 중요한 의미를 갖습니다. 우리는 또한 간단한 제조 방법에있어서, 확장 성, 가변 생분해 속도 등의 뮤코 접착제, 약물 방출 패치, 상처 치료 드레싱 등과 같은 의약 다양한 용도 TAPE의 광범위한 사용을 기대할뿐만 아니라 높은 습기에 강한 ADHES이온 특성.

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프로토콜

모든 동물 관리 및 실험은 KAIST (한국 과학 기술원)에서 제공하는 윤리적 프로토콜 IRB (임상 시험 심사위원회)에 따라 수행된다.

1. TAPE 형성

1. 트랜스 용액의 제조 마그네틱 스터에 4 mL의 크기의 유리 병을 놓고, 교반 막대 증류수 1 ㎖를 추가한다. 바이알에 탄닌산 1 g을 넣고, 이상에서 1 시간 동안 200 rpm에서 온화하게 교반하여 물에 녹인다. TA에 완전히 용해 될 때, 혼합물은 갈색 투명해진다.
2. 백색 슬러리를 만들기 위해 몇 초 동안 볼 텍싱하여 이들을 혼합하여 증류수 1 ㎖ 다음에 PEG 분말 1g (4 아암 10 kDa의, 리니어, 4.6 kDa의)을 첨가하여 PEG 용액을 제조 하였다. 10 분 동안 60 ° C의 배양기에서 슬러리를 유지한다. 흰색 하나는 완전히 명확해질 때까지.
   참고 : 10 kDa의 분자량을 갖는 PEG의 융점이 약 55 인- 60 ℃, 및 4 kDa의 하나는 53 - 58 °의 C. 1g에 물까지의 PEG의 고농도 / ㎖의 투명한 용액으로 얻어 질 수 있도록 용융 된 PEG는 수혼 화성된다. 맑은 PEG 용액을 고온에서 형성되면, 용액을 계속 냉각 한 후, 실온에서 안정하다.
3. PEG의 329 μl를 추가 (4 아암 10 kDa의) 용액 4.6 kDa의 갖는 선형 PEG의 경우 1.1 단계에서 얻어진 TA 용액 (1.2 671 μL를 위해 PEG 용액 311 μL를 추가 단계에서 제조 한 마이크로 원심 분리기 튜브에서 TA 용액) 689 μL. 조심스럽게 균일를 혼합 좁은 주걱 두 점성과 꿀 같은 솔루션을 혼합.
   주의 : 두 솔루션은 매우 점성, 그래서 과학자가 느리지 만 충분히 끌어와 마이크로 피펫으로 솔루션을 전송해야합니다.
4. 고정 된 앵글 로터를 구비 한 원심 분리기에서 3 분 동안 12,300 × g으로 1.3로 공정에서 제조 한 혼합물을 스핀.
5. 조심스럽게 렘마이크로 피펫을 사용하여 가능한 한 상등액만큼 비켜하고 침착 한 생성물을 수집 :이 완전히 형성 TAPE이다. . TAPE 형성 한 후, 냉장고에서 보관 - 몇 주까지 NOTE (4 8 °의 C) : 테이프 감마선 또는 외과 적 용도로 사용하기 전에, 전자 빔 처리에 의해 살균 될 수있다.

테이프의 접착 강도의 측정 (2)

1. 피부 조직의 모든 지방을 제거한 후, 생검 펀치로 절단하여 6mm 직경의 돼지의 피부 조직의 두 개를 준비한다.
   주 : 돼지 피부 조직이 건강한 돼지 측면 피부에서 얻어진 것으로, 한국 대전에 위치한 지역 고기 시장에서 구입했다.
2. 각 조직의 외 측면에 상업 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용하고, 금속 막대에 조직을 연결합니다.
   참고 : 금속로드가 보조 핸들이 그래서를 티슈 사용직접 기계에 의해 사로 잡혔다하지 않았습니다. 따라서, 인장 기의 구성을 다음과 같은 다른 물질로 대체 될 수있다.
3. 티슈의 한쪽 - TAPE 방울을 적용 (6 mg의 테이프의 드롭은 약 3 임). 이어서,도 2a에 도시 한 바와 같이 이들이 부착되도록 균일 그 내측에있는 두 개의 다른 조직 사이의 조직을 사용하여 테이프를 확산.
4. 그 후, 수동으로 균일하게 혼합하고, 각 조직 테이프 사이의 계면을 극대화 수회 부착 조직의 양쪽 분리.
5. UTM을로,로드의주의 그립 각면. 접착 강도는 테이프 부착 개의 조직을 분리하는 데 필요한 힘에 의해 결정된다. 첫째, 1 분 20 N의 힘을 적용합니다. 이어서, 기계로, 1mm / min의 속도로 반대 방향으로 각로드를 당긴다. 때까지 조직을 완전히 분리된다.
   주 : 데이터는 힘 - 거리로 주어질 것이다 (FD) 곡선 움직임 검출각로드.
6. 즉, 시편 표면적에 의해 단계 250에서 달성 된 FD 곡선에 도시 된 최대 힘 (KN)을 분할하여 테이프의 접착 강도를 계산 3.14 × (0.003 m) ^2.
7. 물의 존재 하에서 접착 강도를 모니터링하기 위해, 두 조직 사이의 분리 영역 상에 20 μL의 물을 추가하고, 즉시 첨부. 기계로 다시 분리 테스트를 수행합니다.

3. 체외 저하 테스트

1. 마이크로 원심 분리 튜브의 캡 (d = 8 mm)를 잘라내, 및 W의 _C로 정의 캡을 단다.
2. TAPE 150 mg을 가진 캡을 입력하고 ₀ W 총 초기 무게로 설정을 다시 모두 함께 무게.
   주의 : 모자 TAPE를 너무 많이 넣지 마십시오. 이 단계 3.4에서 배양 동안 교반 처리에 의해 생성 된 PBS 완충액의 흐름에 대한 물리적 장벽을 될 수있는 테이프의 높이가 상기 캡의 상단보다 낮아야한다.
3. 세포 배양 용 플라스크에 테이프를 포함하는 캡을 넣어 (75cm ²⁾ 및 PBS 완충액 50 mL로 (1X, pH 7.4의) 세포 배양 플라스크에 뚜껑 테이프가 완전히 같이, PBS 완충액에 침지되도록 추가 도 3a에 도시 한 (N = 5).
4. 부드럽게 교반 (50 RPM)와 생리 학적 조건과 유사한 37 ℃에서 오비탈 진탕 배양기 단계 3.3에서 제조 된 세포 배양 플라스크를 인큐베이션.
   주의 : 50 rpm으로 교반 상태를 유지합니다. 높은 RPM은 TAPE의 붕괴가 발생할 수 있습니다.
5. 각 시점에서, 세포 배양 플라스크에서 테이프로 뚜껑을 한 후, 질소 가스를 불어 건조한다. 남은 테이프를 포함하는 캡을 단다. W _t의 각 시점에서의 무게를 설정한다. 다시 신선한 PBS를 교체하고, 각 시점에서 W _(T)를 측정 한 후이를 다시 흔들.
6. 상대적인 잔류 중량 (%)은 다음 식을 계산한다.
   상대 남은 중량 (%) = (W의 _t - W의 _C) / (W ₀ - W _C) × 100 %

TAPE 4. 지혈 능력

주 : 모든 동물 실험은 보건 복지부 한국 정부가 제공하는 가이드 라인과 윤리 프로토콜에 따라 수행되어야한다.

1. REF ^(24)에 기재된 바와 같이 생체 내 지혈 능력을 평가하기 위해, 마우스를 출혈 간 모델을 검토.
2. (그룹 당 n = 5) tiletamine-zolazepam (33.333 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (7.773 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사와 - 십오 마우스 (남성 35g, 정상 ICR 마우스 6 주, 30) 마취. 적절한 마취를 확인하려면, 동물의 발을 부드럽게 꼬집어 어떤 운동이 동물이 수술을하기에 충분히 마취 있음을 나타냅니다 등, 발을 인출하는 등의 움직임을 관찰한다.
3. 동물의 눈의 건조를 방지하려면 아래에 충분히 동안 눈에 수의사 연고를 적용하려면esthesia. 중간 선 복부 절개를 통해 간을 노출하고 출혈을 유도하기 위해 18 G 바늘로 간을 찌르.
4. 멸균 거즈로 흐르는 혈액을 제거하고 출혈 사이트에 즉시 TAPE 또는 피브린 접착제 (양성 대조군) 100 ㎕를 넣어.
   참고 : 더 이상 봉합으로 인해 상처 조직에 대한 고도의 혈액에 강한 접착 특성에 TAPE를 적용한 후 필요하지 않습니다. 음성 대조군의 경우, 치료는 출혈의 사이트에서 발생하지 않는다.
5. 각각의 경우, 파손 부위로부터 혈액을 수집 간 아래 공지 질량 여과지 넣어. 새로운 일 4 회 매 30 초 (즉., 2 분)으로 용지를 교체합니다.
6. 매 30 초마다 수집 된 여과지에 흡수 된 혈액의 질량을 측정한다. 동물 실험 후, CO ₂ 질식의 안락사를 통해 쥐를 희생.

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결과

1 부피비 (도 1A) TAPE는 TA (1 ㎍ / ml의 증류수)과 2 PEG (1 ㎍ / ml의 증류수)을 포함하는 두 수용액의 혼합물을 원심 분리 한 후 정착 초분자 집합체이다. 혼합 비율이 높은 접착 강도를 달성하는 데 중요한 요소이다 테이프 2로 형성하는 경우 : 1의 혼합비, TA, 25 단위의 수산기 (-OH)의 20 개는 최대 높은 분자간 수소 결합 형성의 결과로, PEG의 각 에테르 기 (-O-)와 상호 ...

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토론

우리는 식물 유래 폴리 페놀 화합물, TA의 방수 분자 상호 작용에 의해 영감을 지혈 접착제라는 TAPE의 완전히 새로운 클래스를 개발했다. TA 크게 인해 산화 방지제, 항균 항 돌연변이 및 항암 특성으로 주목을 받고 대표 가수 분해성 탄닌이다.

그것은 더 화학 합성 과정없이 다음, 원심 분리하여 두 수용액의 단지 한 단계 혼합 같이 테이프를 제조하는 과정은 매우 간단하고 확...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tannic acid	Sigma-aldrich	403040
Poly(ethylene oxide), 4-arm, hydroxy terminated	Aldrich	565709	Averge Mn ~ 10,000
Poly(ethylene glycol)	Aldrich	373001	Average Mn 4,600
Biopsy punch	Miltex	33-36	Diameter = 6 mm
Aron Alpha	Toagosei Co., Ltd.		Instant glue
Universal testing machine (UTM)	Instron	5583
Microcentrifuge tubes	SPL life science	60015	1.5 ml
Petri dish	SPL life science	10090	90 x 15 mm
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	1x PBS ingredient
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S5136	1x PBS ingredient
Sodium chloride	Duchefa biochemie	S0520.5000	1x PBS ingredient
Incubating shaker	Lab companion	SIF6000R
ICR mice	Orient bio	Normal ICR mouse	6 weeks, 30 - 35 g, male
Tiletamine-zolazepam (Zoletil 50)	Virbac
Zylazine (Rompun)	Bayer
PrecisionGlideTM needle (18 G)	BD	302032	18 G
Filter paper	Whatman	1001 125	Diameter = 125 mm
Parafilm	Bemis Flexible Pakaging	PM996