TAPE: דבק עוצר דמום אורגני בהשראת תרכובת ניכרת בכל היבט של צמחים עבור יישום כירורגי

Summary

אנו מתארים את הפרוטוקול הפשוט ביותר להכין דבק רפואי מתכלה שיש לו יכולת עוצר דמום יעילה. קלטת היא המצרפי מולקולרי מי immiscible המוכן על ידי ערבוב של חומצה טאני, תרכובת בכל מקום הנמצאת בצמחים, ו פולי (אתילן) גליקול, מניב 2.5 פעמים יותר הדבקה עמידה במים לעומת דבק הפיברין מסחרי.

Abstract

וידאו זה מתאר את הפרוטוקול הפשוטה להכנת דבק כירורגים מתכלה שיש לו יכולת עוצר דמום יעיל חוזק הדבקה עמיד במים יותר מאשר דבקי רקמה מסחריים. דבקים רפואיים משכו תשומת לב רבה כמו כלים חלופיים פוטנציאל תפרים ואת הסיכות בשל הנוחות שלהם בשימוש עם הפולשנות מינימאלי. אמנם ישנם מספר פרוטוקולים לפיתוח דבק רקמות כולל אלה זמינים מסחריים כגון דבקי הפיברין וחומרים מבוססים cyanoacrylate, בעיקר הם דורשים שורה של סינתזות כימיות של מולקולות אורגניות, או שיטות חלבון טיהור מסובכות, במקרה של חומרים מונעים ביו (כלומר, דבק הפיברין). כמו כן, פיתוח דבקים כירורגית מפגין תכונות הדבקה גבוהות תוך שמירה על פריקות ביולוגיות היא עדיין אתגר בשל קשיים בהשגת ביצועים טובים בסביבה הרטובה של הגוף. אנו להמחיש שיטה חדשה להכיןדבק רפואי, המכונה TAPE, על ידי ההפרדה מבוססת במשקל של המצרפי מולקולרי מי immiscible נוצר לאחר ערבוב פיזי של מולקולה דבקה צמחית, רטובה עמידה, T annic מזהה לקוח (ת"א), ובאר-ידוע biopolymer, פולי (אתילן) גליקול (PEG). עם הגישה שלנו, TAPE מראה חוזק הדבקה גבוהה, שהוא פי 2.5 יותר מאשר דבק הפיברין מסחרי בנוכחות מים. יתר על כן, TAPE מתכלה בתוך מצבים פיזיולוגיים יכול לשמש דבק עוצר דמום חזק נגד דימום רקמות. אנו מצפים כי השימוש הנרחב של TAPE במגוון הגדרות רפואיות יישומי משלוח סמים, כגון ופולימרים-הידבקות muco, מחסני סמים, ואחרים.

Introduction

בתוך העשור אחרון, נעשו מאמצים להחליף תפרים ואת סיכות כירורגיות נוכחיים לסגור פצעים עם דבקים מתכלים / bioabsorbable בשל הנוחות שלהם שימוש הפולשנות רקמות נמוכות במהלך טיפולים כירורגיים. זמין מסחרי רקמות-דבקים מסווגים לארבעה סוגים: (1) נגזר cyanoacrylate ^1, (2) דבקי הפיברין נוצרו על ידי המרה אנזימטית מן פיברינוגן כדי הפיברין פולימרים ידי תרומבין ^2,3, (3) חומרים מבוססי חלבון כגון כימי או פיזי אלבומין צולב ו / או ג'לטין ^4,5, ו (4) סינטטי פולימר המבוסס אלה ^6. למרות שהם כבר בשימוש ביישומים קליניים רבים, יש כל הדבקים חסרונות העצמיים שלהן ואת חסרונות שיכולים להיות מכשולי השימוש הנרחב שלהם. דבקים מבוססי Cyanoacrylate להראות חוזק הדבקה גבוהה לרקמות, אבל שלהם רעילים תוצרי לוואי כגון cyanoacetate פורמלדהיד נוצרו במהלך השפלה, לעיתים קרובות לגרום סימןמעלות ificant של תגובות דלקתיות ^7. דבקי פיברין ואלבומין או חומרים מבוססים ג'לטין יש בעיות בטיחות בנוגע להעברת רכיבים זיהומיות, כגון וירוסים מן החי: פלזמת דם אדם עבור דבקי הפיברין וחיות כוללים בקר, עוף, חזיר, ודגים עבור דבקים מבוססים ג'לטין ^8. למרות דבקים סינתטיים כמה מבוססי פולימרים אושרו על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA), רוב דבקים פולימרים סינתטיים תמשיך להיתקל בקשיים למזער את השלבים בתהליך הייצור והשגת biocompatibility ^9. והכי חשוב, כל הדבקים סובלים חוזק מכני הידבקות עני לרקמות רטובות ^10. לאחרונה, דבקי רקמת biomimetic בהשראת מולים ימיים ^11-13, שממיות ^14, שממית עם שבלול ^15, ותולעי endoparasitic ¹⁶ כבר המתעוררים חלופות מבטיחות באשר דבקים רפואיים נוכחיים בשל מכאני המתכונן שלהםתכונות דבקות עם התאמה ביולוגית. עם זאת, עד עצם היום הזה, עדיין יש בעיות להיות מטופל לפני שהן הופכות מוצרים מסחריים ^17.

כאן אנו מדווחים סוג חדש לגמרי של דבק רפואי הנקרא TAPE כי הוא הוכן על ידי מליטת המימן מולקולאריים בין מולקולה דבקה צמחית, חומצה טאנית (ת"א), ו פולימר ביו-אינרטי midi (אתילן גליקול) (PEG), כשמו כן. ת"א היא טאנין hydrolysable נציג נמצא בכל מקום בגוף במהלך המטבוליזם המשני של צמחים. זה משך תשומת לב רבה בשל החמצון אנטי שלה, אנטי מוטגנים, ונוגדות מסרטנים הוכח להשתתף באינטראקציות מולקולריות עם פולימרים רבים, כגון פולי (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) ו poly (N - vinylpyrrolidone) (PVPON), כדי ליצור שכבת-ידי שכבתי (LbL) סרטי ^18-20 סמים משחררים microcapsules ^21-23. במחקר זה, אנו מגלים כי ת"א יכולה לשמש יעילעמיד במים מחצית פונקציונלי דבק כדי ליצור דבק רפואי, TAPE. על ידי ערבוב פשוט עם TA, פג פולימר בלתי עכירות הופך דבק מולקולריים עם פי 2.5 חוזק הדבקה מוגברת לעומת דבק הפיברין מסחרי, הידבקות זו נשמרה לאורך עד 20 מחזורים של התקשרות וניתוק, אפילו בנוכחות של מים . היכולת עוצר דמום שלה נבדקה על מודל דימום כבד in vivo והראתה יכולת עוצר דמום טוב כדי לעצור את הדימום תוך מספר שניות. TAPE יש משמעות משמעותית שלה בתחום שקשור כמו דבק הצמחי הראשון אשר יכול לחשוף תובנות חדשות לפתרון החסרונות של הבעיות הנוכחיות עם גישות ביו-השראה. כמו כן, אנו צופים כי השימוש הנרחב של TAPE במגוון יישומים רפואיים ותרופות כגון-דבקי muco, טלאי שחרור תרופות, תחבושות פצע טיפול, ואחרים בשל שיטת הכנה הפשוטה שלה, מדרגיות, שיעור ההתכלות מתכונן, כמו גם adhes רטוב עמיד מאודנכסי יון.

Protocol

כל טיפול הניסויים בבעלי החיים מבוצעים בהתאם לפרוטוקול האתי שמספק (המכון המתקדם קוריאה מדע והטכנולוגיה) KAIST IRB (דירקטוריון סקירה מוסדי).

1. גיבוש TAPE

1. להכנת פתרון ת"א, למקם בקבוקון זכוכית 4 מ"ל בגודל על בוחש מגנטי, ולהוסיף 1 מ"ל של מים מזוקקים עם בר בחישה. הוסף 1 גרם של חומצת טאני הבקבוקון, לפזר אותו בתוך המים על ידי ערבוב עדין ב 200 סל"ד במשך יותר מ 1 hr. כאשר ת"א נמסה לגמרי, התערובת הופכת שקופה עם צבע חום.
2. הכן פתרון PEG על ידי הוספת 1 גרם של אבקת PEG (4-נשק, 10 kDa, ולינארית, 4.6 KDA) עד 1 מ"ל מים מזוקקים ואחריו ערבוב אותם על ידי vortexing במשך כמה שניות כדי לעשות slurry לבן. שמור slurry זה בחממה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. עד אחד לבן הופך לגמרי ברור.
   הערה: נקודת ההתכה של PEG עם 10 משקל מולקולרי kDa היא סביב 55- 60 ° C, ואת אחד 4 kDa הוא 53 - 58 ° C. נמס PEG הופך-בליל מים כך ריכוז גבוה של PEG במים עד 1 גרם / מ"ל ​​ניתן להשיג כפתרון ברור. לאחר פתרון PEG ברור נוצר בטמפרטורה גבוהה, הפתרון הוא עדיין יציב בטמפרטורת חדר לאחר הקירור.
3. להוסיף 329 μl של PEG (4-נשק, 10 KDA) פתרון מוכן בשלב 1.2 ל 671 μl של פתרון ת"א מוכן בשלב 1.1 (במקרה של PEG ליניארי עם 4.6 kDa, להוסיף 311 μl של פתרון PEG כדי 689 μl של פתרון ת"א) בצינור מיקרו צנטריפוגות. בעדינות למזג את שני פתרונות צמיגים ודבש דמוי עם מרית צרה לערבב אותם בצורה הומוגנית.
   זהירות: שני הפתרונים הם די צמיגים, אז המדען חייב לאט אבל מספיק להרים ולהעביר פתרונות עם micropipette.
4. ספין את התערובת מוכנה בשלב 1.3 ב 12,300 XG במשך 3 דקות בצנטריפוגה מצוידת הרוטור קבוע זווית.
5. בזהירות remove כמה שיותר supernatant ככל האפשר באמצעות micropipette, לאסוף את המוצר אשר התיישבו: זהו TAPE נוצר באופן מלא. לאחר היווצרות TAPE, לאחסן אותו במקרר (4 - 8 ° C) עד מספר שבועות הערה:. TAPE ניתן לעקר על ידי קרינת גמא או טיפול אלומת אלקטרונים לפני השימוש ביישומים כירורגית.

מדידה 2. של חוזק הדבקה של TAPE

1. הכן שתי חתיכות של רקמות עור חזיריות בקוטר של 6 מ"מ על ידי חיתוך עם ביופסיה לאחר הסרת כל השומן על רקמת העור.
   ההערה: רקמת העור החזירית הושגה מעור אגף חזירי בריא נרכשה שוק בשר מקומי הממוקם Daejeon בדרום קוריאה.
2. החל דבק cyanoacrylate מסחרי לצד החיצוני של כל רקמות, ולצרף את הרקמה למוט מתכת.
   הערה: מוט המתכת משמש כידית משלים כך רקמותמחדש לא אחז ישירות על ידי מכונה. בהתאם לכך, זה יכול להיות מוחלף עם חומרים אחרים לאחר התצורה של מכונת המתיחה.
3. החל ירידה של TAPE (ירידה של הקלטת הוא כ 3 - 6 מ"ג) לצד אחד של הרקמה. לאחר מכן, להפיץ את הקלטת באופן אחיד בעזרת רקמות נוספות בין שתי הרקמות על הדפנות הפנימיות שלהם, כך הם מחוברים כמוצג איור 2 א.
4. ואז, באופן ידני לצרף ולנתק שני הצדדים של רקמות מספר פעמים כדי לערבב homogenously ולמקסם את ממשק בין כל רקמות TAPE.
5. עם UTM, אחיזה בזהירות בכל צד של המוט. כוחו ההידבקות ייקבע על ידי הכח הדרוש כדי לנתק שתי רקמות מצורפות עם TAPE. ראשית, להפעיל כוח של 20 N 1 דקות. לאחר מכן, עם המכונה, למשוך כל מוט בכיוון הפוך בשיעור של 1 מ"מ / דקה. עד הרקמות מנותקות לחלוטין.
   הערה: נתונים יינתנו בתור למרחקי כוח (FD) עקום זוהה על ידי התנועהשל כל מוט.
6. חשב את החוזק הדבק של TAPE ידי חלוקת הכח המקסימאלי (kN) הראה בעיקול FD מושג בשלב 2.5 ידי שטח פן הדגימה, כלומר, 3.14 x (0.003 מ ') ^2.
7. לניטור החוזק הדבקה בנוכחות מים, להוסיף 20 μl של מים על האזור המנותק בין שתי רקמות, ולצרף אותם מייד. עם המכונה, לבצע את בדיקת הניתוק שוב.

3. מבחן הביזוי חוץ-גופית

1. חותכים כיפה (ד = 8 מ"מ) של צינור מיקרו צנטריפוגות, ולשקול את הכובע להגדירה _ג W.
2. מלא את הכובע עם 150 מ"ג של TAPE, ולשקול הכל ביחד שוב להגדיר את זה בתור משקל ההתחלתי הכולל W _0.
   זהירות: אל תעמיס TAPE בכובע. גובה TAPE צריך להיות נמוך מחלקו העליון של הכובע, כפי שהוא יכול להיות מכשול פיזי כדי זרם של חיץ PBS הנוצרים בתהליך הערבוב במהלך הדגירה בשלב 3.4.
3. לשים את הכובע המכיל TAPE לתוך בקבוק תרבית תאים (75 ס"מ ^2), ולהוסיף 50 מ"ל של חיץ PBS (1x, pH 7.4) אל הבקבוק תרבית תאים כך TAPE בכובע הוא שקוע לחלוטין חיץ PBS, כפי שמוצג באיור 3 א (n = 5).
4. דגירה בקבוק תרבית תאים מוכן בשלב 3.3 באינקובטור רועד מסלולית ב 37 ° C, בדומה בתנאים פיסיולוגיים, עם ערבוב עדין (50 סל"ד).
   זהירות: שמור את מצב הערבוב ב 50 סל"ד. סל"ד גבוה עלול לגרום לקריסה של TAPE.
5. בכל נקודת זמן, לקחת את הכובע עם TAPE מבקבוק תרבית תאים, ולאחר מכן לייבש אותם על ידי פיצוץ גז חנקן. לשקול את הכובע המכיל TAPE הנותרים. הגדר את המשקל בכל נקודת זמן כדי W _t. החזר את PBS הטרי שוב, ולנער אותו שוב לאחר מדידת W _t בכל נקודת זמן.
6. חשב את משקל נותרים היחסי (%) המשוואה הבאה.
   משקל שנותר יחסית (%) = _(t W - _ג W) / (W ₀ - W _ג) x 100%

היכולת של TAPE 4. עוצר דמום

הערה: כל הניסויים בבעלי החיים צריכות להתבצע בהתאם להנחיות הפרוטוקול אתי הניתנות על ידי משרד קוריאני בריאות והרווחה.

1. כדי להעריך את היכולת עוצר דמום vivo, דרג את המודל הכבד דימום העכבר כמתואר נ"צ ^24.
2. להרדים חמש עשרה עכברים (עכבר ICR נורמלי, 6 שבועות, 30 - 35 גרם, זכר) עם זריקה intraperitoneal של zolazepam tiletamine (33.333 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (7.773 מ"ג / ק"ג) (n = 5 לכל קבוצה). כדי לאשר הרדמה ראויה, לצבוט את הכפה של החיה בעדינות ולבחון תנועות כמו משייכת הכף, וכו 'אין תנועה עולה כי בעל החיים הוא הרדים מספיק לעשות ניתוח.
3. כדי למנוע יובש של העיניים של החיה, להחיל משחת וטרינר לעיניים מספיק זמן תחתesthesia. לחשוף את הכבד דרך חתך בבטן קו האמצע, ואת הזין הכבד עם מחט 18 G כדי לגרום לדימום.
4. הסר את הדם זורם עם גזה סטרילי, ולשים 100 μl של קלטת או דבק הפיברין (בקרה חיובית) מיד באתר דימום.
   הערה: אין תפירה נוספת נדרשה לאחר החלת TAPE בשל מאפיינים דבק בו מאוד עמיד דם ברקמות פצע. לקבלת השליטה השלילית, ללא טיפול מתרחש באתר של דימום.
5. בכל מקרה, לשים נייר פילטר עם מסה ידועה מתחת הכבד כדי לאסוף את הדם מאתר נזק. החלף את הנייר עם אחד טרי מדי 30 שניות במשך 4 פעמים (כלומר., 2 דקות).
6. למדוד את המסה של דם נספג על כל נייר סינון נאספים מדי 30 שניות. לאחר ניסויים בבעלי חיים, להקריב את העכברים באמצעות המתת חסד מחנק ₂ CO.

תוצאות

הקלטת היא המצרפי מולקולרי כי נרגע לאחר centrifuging את התערובת של שני פתרונות מימיים המכילים ת"א (1 גרם / מיליליטר מים מזוקקים) ו PEG (1 גרם / מיליליטר מים מזוקקים) עם 2: 1 יחס נפח (איור 1 א). יחס ערבוב היא גורם מפתח בהשגת חוזק הדבקה גבוהה; כאשר TAPE נוצר על...

Discussion

פתחנו לסוג חדש לגמרי של TAPE בשם הדבק עוצר דמום בהשראת האינטראקציה המולקולרית עמידים במים של תרכובת polyphenolic צמחית, ת"א. ת"א הוא טאנין hydrolysable נציג שמשך משמעותי תשומת לב בשל תכונותיו האנטי-אוקסידנט, אנטי בקטריאלי, אנטי מוטגנים, ואנטי-מסרטנים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tannic acid	Sigma-aldrich	403040
Poly(ethylene oxide), 4-arm, hydroxy terminated	Aldrich	565709	Averge Mn ~10,000
Poly(ethylene glycol)	Aldrich	373001	Average Mn 4,600
Biopsy punch	Miltex	33-36	Diameter = 6 mm
Aron Alpha®	Toagosei Co., Ltd.		Instant glue
Universal testing machine (UTM)	Instron	5583
Microcentrifuge tubes	SPL life science	60015	1.5 mL
Petri dish	SPL life science	10090	90 x 15 mm
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	1x PBS ingredient
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S5136	1x PBS ingredient
Sodium chloride	Duchefa biochemie	S0520.5000	1x PBS ingredient
Incubating shaker	Lab companion	SIF6000R
ICR mice	Orient bio	Normal ICR mouse	6 weeks, 30-35 g, male
Tiletamine-zolazepam (Zoletil 50)	Virbac
Zylazine (Rompun)	Bayer
PrecisionGlideTM needle (18 G)	BD	302032	18 G
Filter paper	Whatman	1001 125	Diameter = 125 mm
Parafilm	Bemis Flexible Pakaging	PM996