ЛЕНТА: Биоразрушаемый кровоостанавливающие клей Вдохновленный Ubiquitous соединения в растениях для хирургических Применение

Резюме

Мы опишем наиболее простой протокол для подготовки биоразлагаемый медицинский клей, который имеет эффективную способность кровоостанавливающее. ЛЕНТА представляет собой не смешивающийся с водой супрамолекулярная агрегат получают путем смешивания дубильной кислоты, повсеместное соединение, содержащееся в растениях, и поли (этилен) гликоля, что дает в 2,5 раза больше водостойкую адгезию по сравнению с коммерческим клеем фибрина.

Аннотация

Это видео описывает простейший протокол получения биоразлагаемого хирургического клея, который имеет эффективную способность кровоостанавливающее и большую водонепроницаемую прочность сцепления, чем клеев коммерческих тканей. Медицинские клеи привлекли большое внимание в качестве потенциальных альтернативных инструментов для наложения швов и скрепок из-за их удобства в использовании с минимальной инвазивности. Несмотря на то, существует несколько протоколов для разработки адгезивов ткани, включая коммерчески доступные, такие как фибрин клеями и цианоакрилатных на основе материалов, в основном, они требуют ряда химических синтезов органических молекул или сложных методов протеин-очистки, в случае био управляемых материалов (то есть, фибриновый клей). Кроме того, разработка хирургических клеев экспонирование высокие адгезионные свойства, сохраняя при этом способность к биологическому разложению остается серьезной проблемой из-за трудностей в достижении хорошей производительности в условиях повышенной влажности тела. Проиллюстрируем новый способ подготовитьмедицинский клей, известный как лента, по весу на основе разделения не смешивающегося с водой супрамолекулярную агрегат , образованный после физического смешивания растительного происхождения, молекулы мокрая водостойкой лентой, Т annic ИДС (ТА), а также хорошо известный биополимер, поли (этилен) (ПЭГ). С помощью нашего подхода, ЛЕНТА показывает высокую прочность адгезии, что в 2,5 раза больше, чем коммерческий клей фибрина в присутствии воды. Кроме того, лента является биоразлагаемым в физиологических условиях, и может быть использован в качестве мощного гемостатического клея против тканевого кровотечения. Мы ожидаем, что широкое использование ленты в различных медицинских учреждениях и приложений доставки лекарственных средств, таких как полимеры для слизисто-адгезии, складов наркотиков и других.

Введение

В последнее десятилетие были предприняты усилия, чтобы заменить существующие хирургические шовные материалы и скобы, чтобы закрыть раны с биоразлагаемыми / биопоглощаемые клеев из-за их удобства в использовании и инвазивности низкой ткани во время хирургического лечения. Коммерчески доступные тканевых клеев подразделяются на четыре типа: (1) производные цианокрилатные ^1, (2) фибриновых клеями , образованные путем ферментативного превращения фибриногена в фибрин полимеров тромбином ^2,3, (3) на основе белка материалы , такие как химически или физически сшитый альбумин и / или желатин ^4,5, и (4) синтетический полимер на основе ⁶ из них. Несмотря на то, что они были использованы во многих клинических применений, все клеи имеют свои собственные внутренние недостатки и недостатки, которые могут быть препятствия для их широкого использования. Цианакрилатные-клеи на основе демонстрируют высокую прочность адгезии к тканям, но их токсичные побочные продукты, такие как цианоацетатным и формальдегида, образующихся при деградации, часто вызывают знакificant степени воспалительных реакций ^7. Фибрина клеи и альбумин или желатин на основе материалы имеют вопросы безопасности , касающиеся передачи инфекционных компонентов, таких как вирусы из животных источников: плазме крови человека для фибриновых клеев и животных , включая крупный рогатый скот, кур, свиней и рыбы для желатина на основе клеев ^8. Хотя некоторые синтетические полимерные клеи на основе были утверждены Федеральным управлением медикаментов (FDA), большинство клеев из синтетических полимеров , продолжают испытывать трудности в деле минимизации шагов производственного процесса и достижение биосовместимости ^9. Самое главное, что все клеи страдают от плохой механической и адгезионной прочности для влажных тканей ^10. В последнее время , клеи биомиметические ткани навеянные морскими мидиями ^11-13 гекконов ^14, геккон с мидий ¹⁵ и эндопаразитических червей ¹⁶ были становятся перспективные альтернативы текущих медицинских клеев из - за их механических и перестраиваемыйадгезионные свойства с биосовместимости. Тем не менее, и по сей день, все еще ​​есть вопросы , которые необходимо решить , прежде чем они станут коммерческими продуктами ^17.

Мы сообщаем о совершенно новый тип медицинского клея под названием ЛЕНТА, который получают путем межмолекулярных водородных связей между растительного происхождения, клеевой молекулы, дубильные кислоты (ТА), и био-инертный полимер поли (этиленгликоль) (ПЭГ), как указывает его название. TA является представителем гидролизуемый танин Повсеместно найдены во время вторичного метаболизма растений. Она привлекает к себе большое внимание в связи с его антиоксидантными, анти-мутагенным, и анти-канцерогенные свойства и было показано , участвовать в супрамолекулярных взаимодействий со многими полимерами, такими как поли (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) и поли (N - винилпирролидона) (PVPON), чтобы сформировать слой за слоем (LBL) пленок ^18-20 и лекарственно-рилизинг микрокапсул ^21-23. В этом исследовании мы обнаружили, что TA может действовать как эффективныйводостойкий клей функциональный фрагмент с образованием медицинского клея, ЛЕНТА. Путем простого смешивания с TA, не-обрастания полимер ПЭГ становится супрамолекулярная клей с 2,5-кратным увеличением адгезионной прочности по сравнению с коммерческим клеем фибрина, и эта адгезия сохраняется на протяжении до 20 циклов прикрепления и снятия, даже в присутствии воды , Его гемостатический способность тестировалась на печень кровоточащей модели в естественных условиях и показали хорошую способность кровоостанавливающее , чтобы остановить кровотечение в течение нескольких секунд. ЛЕНТА имеет существенное значение в соответствующем поле в качестве первого растительного происхождения, клей, который может показать новый взгляд на решение недостатков нынешних проблем, связанных с био-вдохновил подходов. Мы также ожидаем, что широкое использование ленты в различных медицинских и фармацевтических применений, таких как слизисто-клеи, пластыри с наркотиками отпуская, перевязочных помощи, а также других из-за его простой метод подготовки, масштабируемости, перестраиваемой скорости биодеградации, а также высоко влажное устойчивые к adhesионные свойства.

протокол

Все по уходу за животными и эксперименты проводятся в соответствии с этическими протоколом, предоставленной KAIST (Корейский передовой институт науки и технологии) IRB (Institutional Review Board).

1. ЛЕНТА Формирование

1. Для приготовления раствора TA, поместите 4 мл размера стеклянный флакон на магнитной мешалкой, и добавляют 1 мл дистиллированной воды, снабженную стержнем дл перемешивани. Добавляют 1 г дубильной кислоты в пробирку, и растворить его в воде при осторожном перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту в течение более 1 часа. Когда ТА полностью растворяется, смесь становится прозрачным с коричневым цветом.
2. Готовят раствор ПЭГ путем добавления 1 г порошка ПЭГ (4-оружия, 10 кД, и линейные, 4,6 кДа) до 1 мл дистиллированной воды с последующим их смешиванием при помощи вортекса в течение нескольких секунд, чтобы сделать белой суспензии. Хранить эту суспензию в термостате при 60 ° С в течение 10 мин. пока белый человек не станет совершенно ясно.
   Примечание: Температура плавления ПЭГ с 10 кДа молекулярной массой около 55- 60 ° С, а 4 кД один 53 - 58 ° С. Расплавленный PEG становится смешивающиеся с водой, так что высокая концентрация PEG в воде до 1 г / мл может быть достигнуто в виде прозрачного раствора. После того, как прозрачный раствор ПЭГ образуется при высокой температуре, раствор остается стабильным при комнатной температуре после охлаждения.
3. Добавить 329 мкл ПЭГ (4-оружия, 10 кДа) раствор, полученный на стадии 1,2 до 671 мкл раствора TA, полученного на стадии 1.1 (в случае линейного ПЭГ с 4,6 кДа, добавляют 311 мкл раствора ПЭГ 689 мкл раствора, TA) в микро-центрифужные пробирки. Аккуратно смешать два вязкие и медоподобный решения с узким шпателем, чтобы смешать их равномерно.
   ВНИМАНИЕ: Оба решения являются достаточно вязким, так что ученый должен медленно , но достаточно подтянуть и передавать решения с помощью микропипетки.
4. Спин смеси, полученной на стадии 1.3 при 12300 х г в течение 3 мин в центрифуге, снабженной фиксированным угловым ротором.
5. Тщательно бэрОве, как большая часть надосадочной жидкости, как это возможно с помощью микропипетки, и собрать продукт, который оседает вниз: Это полностью сформированный ЛЕНТА. После формирования TAPE, храните его в холодильнике (4 - 8 ° С) в течение до нескольких недель . ПРИМЕЧАНИЕ: ЛЕНТА можно стерилизовать с помощью гамма - излучения или обработки электронного пучка до использования в хирургических приложениях.

2. Измерение Прочность сцепления TAPE

1. Подготовьте два куска свиной ткани кожи с диаметром 6 мм резанием с трепанобиопсия после удаления всех жира на ткани кожи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: свиная ткань кожи была получена от здоровых свиней фланговой кожи и был приобретен у местного рынка мяса , расположенного в городе Тэджон в Южной Корее.
2. Применение коммерческого цианакрилатный клей на внешней стороне каждой ткани, и прикрепить ткань к металлическому стержню.
   Примечание: Металлический стержень используется в качестве дополнительной рукоятки так тканейповторно непосредственно не охвачена машиной. Соответственно, он может быть заменен другими материалами, после конфигурации машины на растяжение.
3. Нанесите каплю TAPE (капля TAPE составляет приблизительно 3 - 6 мг) на одну сторону ткани. Затем распространить TAPE равномерно с помощью другой ткани между двумя тканями на их внутренних сторонах , чтобы они присоединены , как это показано на рисунке 2А.
4. Затем вручную прикрепить и снять обе стороны тканей несколько раз гомогенно смешивать и максимизируют интерфейс между каждой ткани и ленты.
5. С UTM, тщательно сцепление с каждой стороны штанги. Прочность сцепления будет определяться силой, необходимой для отсоединения двух тканей, прикрепленные с помощью клейкой ленты. Во-первых, применить силу 20 Н в течение 1 мин. Далее, с машиной, тянуть каждый стержень в противоположном направлении со скоростью 1 мм / мин. до тех пор, пока ткань полностью отсоединена.
   Примечание: Данные будут даны в качестве силы расстояния (FD) кривая обнаруживается движениекаждого стержня.
6. Рассчитать прочность сцепления ленты с помощью деления максимальной силы (кН) , показанную на кривой FD , достигнутый на шаге 2.5 на площадь поверхности образца, то есть 3,14 х (0,003 м) ^2.
7. Для контроля прочности адгезии в присутствии воды, добавить 20 мкл воды на Дистанционная область между двумя тканями, и присоединить их немедленно. С машиной, выполнить тест снова отряд.

3. In Vitro Деградация Test

1. Отрежьте колпачок (d = 8 мм) микро-центрифуге трубки и взвесить крышку для того чтобы определить его как W _с.
2. Заполните крышку с 150 мг TAPE, и взвесить все вместе снова , чтобы установить его в качестве общего первоначального веса W _0.
   ВНИМАНИЕ: Не перегружайте ЛЕНТА в крышке. Высота лента должна быть ниже, чем в верхней части крышки, так как он может быть физическим барьером для потока буфера PBS, генерируемого в процессе перемешивания в течение инкубации на стадии 3.4.
3. Наденьте крышку , содержащую кассету в культуре клеток колбу (75 см ^2), и добавьте 50 мл буфера PBS (1x, рН 7,4) в колбу для культивирования клеток , так ЛЕНТА в крышке полностью погружен в буфере PBS, а показано на фигуре 3А (п = 5).
4. Выдержите в колбу для культивирования клеток, полученного на стадии 3.3, в орбитальном встряхивании инкубаторе при температуре 37 ° С, аналогично физиологических условиях, при осторожном перемешивании (50 оборотов в минуту).
   ВНИМАНИЕ: Держите условие перемешивания при 50 оборотах в минуту. Более высоких оборотах может вызвать коллапс ленты.
5. В каждый момент времени, возьмите крышку с лентой из колбы для культивирования клеток, а затем высушить их продувкой газообразным азотом. Взвесьте колпачок, содержащий оставшейся ленты. Установите вес в каждый момент времени к W _т. Снова заменить свежим PBS, и встряхнуть его снова после измерения W _т в каждый момент времени.
6. Вычислить относительную Остаточный вес (%) по следующему уравнению.
   Относительная Остаточный вес (%) = (W _т - W _с) / (W ₀ - W _с) х 100%

4. кровоостанавливающие Способность TAPE

Примечание: Все эксперименты на животных должны проводиться в соответствии с руководящими принципами и этическим протоколом , предоставленным Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея.

1. Для того, чтобы оценить способность кровоостанавливающее в естественных условиях, обзор модели печени кровоизлияние мыши , как описано в ссылке ^24.
2. Обезболить пятнадцать мышей (нормальная ICR мышь, 6 недель, 30 - 35 г, самцы) с внутрибрюшинного введения tiletamine-zolazepam (33,333 мг / кг) и ксилазина (7,773 мг / кг) (п = 5 на группу). Для того, чтобы подтвердить правильность обезболивание, щепотка лапу животного аккуратно и наблюдать движения , такие как снятие лапу и т.д. Движение не указывает на то, что животное достаточно наркозом делать операцию.
3. Для того, чтобы предотвратить сухость глаз животного, нанесите мазь ветеринара глаза достаточно в то время как подESTHESIA. Обнажить печень через срединный разрез брюшной стенки, и колоть печень с 18 G иглой, чтобы вызвать кровотечение.
4. Удалите текущую кровь с стерильную марлю и положить 100 мкл TAPE или фибринового клея (положительный контроль) непосредственно на месте кровотечения.
   Примечание: Никаких дополнительных ушивание не требуется после применения ЛЕНТА из - за его высокой устойчивостью крови адгезионных свойств на раневых тканей. Для отрицательного контроля, никакая обработка не происходит в месте кровотечения.
5. В каждом случае, положить фильтровальную бумагу с известной массой под печенью, чтобы собрать кровь из места повреждения. Замените бумагу на свежую через каждые 30 секунд в течение 4 -х раз (то есть., 2 мин).
6. Измеряют массу поглощенной крови на каждый бумажный фильтр собирают каждые 30 сек. После эксперимента на животных, принести в жертву мышей через СО ₂ удушья эвтаназии.

Результаты

ЛЕНТА представляет собой супрамолекулярная агрегат , который оседает после центрифугирования смеси двух водных растворов , содержащих TA (1 г / мл в дистиллированной воде) и ПЭГ (1 г / мл в дистиллированной воде) с 2: 1 (объемное соотношение Рис . 1А) Соотнош...

Обсуждение

Мы разработали совершенно новый класс гемостаза клеевой названный ЛЕНТА вдохновлен водостойкого молекулярного взаимодействия полифенолов соединения растительного происхождения, TA. TA является представителем гидролизуемый танин, который значительно привлек к себе внимание благода?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tannic acid	Sigma-aldrich	403040
Poly(ethylene oxide), 4-arm, hydroxy terminated	Aldrich	565709	Averge Mn ~10,000
Poly(ethylene glycol)	Aldrich	373001	Average Mn 4,600
Biopsy punch	Miltex	33-36	Diameter = 6 mm
Aron Alpha®	Toagosei Co., Ltd.		Instant glue
Universal testing machine (UTM)	Instron	5583
Microcentrifuge tubes	SPL life science	60015	1.5 mL
Petri dish	SPL life science	10090	90 x 15 mm
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	1x PBS ingredient
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S5136	1x PBS ingredient
Sodium chloride	Duchefa biochemie	S0520.5000	1x PBS ingredient
Incubating shaker	Lab companion	SIF6000R
ICR mice	Orient bio	Normal ICR mouse	6 weeks, 30-35 g, male
Tiletamine-zolazepam (Zoletil 50)	Virbac
Zylazine (Rompun)	Bayer
PrecisionGlideTM needle (18 G)	BD	302032	18 G
Filter paper	Whatman	1001 125	Diameter = 125 mm
Parafilm	Bemis Flexible Pakaging	PM996