BANT: Cerrahi Uygulama için Bitkilerde bir Ubiquitous Bileşik esinlenerek bir Biyobozunur Hemostatik Tutkal

Özet

Biz etkin bir hemostatik yeteneğine sahip biyobozunur tıbbi tutkal hazırlamak için basit protokol açıklar. ŞERİT tannik asit karıştırılması ile hazırlanan bir suyla karışmayan supramoleküler agrega olan ticari fibrin yapıştırıcı ile karşılaştırıldığında 2.5 kat daha fazla suya dayanıklı yapışma, sonuçta, her yerde bulunan bir bileşik, bitkilerde bulunan ve poli (etilen) glikol.

Özet

Bu video, ticari doku yapıştırıcıları daha etkili bir hemostatik yeteneği ve daha suya dayanıklı yapışma gücüne sahiptir biyobozunur cerrahi yapıştırıcı hazırlanması için basit protokol tanımlamaktadır. Tıbbi yapıştırıcılar nedeniyle minimal invaziv özelliğe sahip kullanımı onların kolaylık sütür ve zımba potansiyel alternatif araçları gibi büyük ilgi çekmiştir. biyo-odaklı malzemeler durumunda örneğin, fibrin tutkalları ve siyanoakrilat bazlı malzemeler ticari olarak temin edilebilen, daha çok organik moleküller ya da karmaşık bir protein saflaştırma yöntemleri kimyasal sentezler, bir dizi ihtiyaç dahil olmak üzere doku yapıştırıcı geliştirmek için çeşitli protokoller, olmasına rağmen (yani, fibrin yapıştırıcı). Ayrıca, cerrahi yapıştırıcı geliştirme yıkma muhafaza nedeniyle vücudun ıslak bir ortamda iyi bir performans sağlamada zorluklar hala bir meydan okuma ise yüksek yapışma özellikleri sergileyen. Bir hazırlamak için yeni bir yöntem gösterilmektedirbitkisel kökenli bir ıslak-dirençli bir yapıştırıcı molekülün fiziksel karıştırma sonrasında oluşturulan bir su ile karışmayan supramoleküler agrega ağırlığı bazlı ayırma ile, bant olarak bilinen tıbbi yapıştırıcı, T, bir CID (TA), ve iyi bilinen Annic biyopolimer, poli (etilen) glikol (PEG) içerebilir. Bizim yaklaşımla, BANT su varlığında ticari fibrin yapıştırıcı daha 2.5 kat yüksek yapışma gücü gösterir. Ayrıca, BANT fizyolojik koşullarda biyolojik olarak parçalanabilir ve doku kanamaya karşı güçlü bir hemostatik yapıştırıcı olarak kullanılabilir. Böyle muko-yapışması için polimerler, ilaç deposu, ve diğerleri gibi tıbbi ortamlarda ve ilaç verme uygulamalarında, çeşitli TAPE yaygın kullanımı bekliyoruz.

Giriş

Geçmiş on yılda, çabaları nedeniyle cerrahi tedaviler sırasında kullanımı ve düşük doku invazivliğinde onların kolaylık biyolojik olarak parçalanabilen / biyo-emilebilir yapıştırıcılar ile yaraları kapatmak için mevcut cerrahi sütür ve zımba yerine yapılmıştır. Ticari olarak temin edilebilen doku yapıştırıcılar, dört tip olarak sınıflandırılırlar: (1) siyanoakrilat türevleri ^1, (2) ^2,3 trombin polimerlerin fibrinojenin fibrine gelen enzimatik dönüşümü ile oluşan fibrin tutkalları, (3) bu tür kimyasal olarak ya da fiziksel olarak protein-esaslı malzemeler çapraz bağlanmış albümini ve / ya da jelatin ^4,5, ve (4) bir sentetik polimer bazlı olanlar ^6. birçok klinik uygulamalarda kullanılmaktadır olmasına rağmen, tüm yapıştırıcılar, kendi içsel dezavantajları ve bunların yaygın kullanımına engel olabilir dezavantajları var. Siyanoakrilat bazlı yapıştırıcılar dokulara yüksek yapışma gücünü gösterir, ama onların zehirli yan ürünler gibi bozunma sırasında oluşan siyanoasetat ve formaldehit gibi, sık sık işaret nedeninflamatuar tepkilerin ⁷ ificant derece. Jelatin bazlı yapıştırıcıların ⁸ sığır, tavuk, domuz ve balık gibi fibrin yapıştırıcılar ve hayvanlar için insan kanı plazmasından: Fibrin yapıştırıcılar ve albümin veya jelatin bazlı malzemeler gibi hayvansal kaynaklardan virüsler gibi enfeksiyöz bileşenlerin iletimi ile ilgili güvenlik sorunları var. Bir kaç sentetik polimer bazlı yapıştırıcılar Federal İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanmış olmasına rağmen, sentetik polimerlerin yapılmış en yapıştırıcılar üretim süreci adımlarını en aza indirmek ve biyouyumluluk ⁹ ulaşmada zorluklar yaşamaya devam. En önemlisi, tüm yapıştırıcılar ıslak mendil ¹⁰ zayıf mekanik ve yapışma mukavemeti muzdarip. Son zamanlarda, deniz midye ^11-13, kertenkeleleri ^14, midye ¹⁵ kertenkele ve Endoparazitik solucanlar ¹⁶ esinlenerek biomimetic doku yapıştırıcıları nedeniyle ayarlanabilir mekanik ve mevcut tıbbi yapıştırıcı olarak umut verici alternatifler ortaya çıkmaktadırlarbiyouyumluluk ile yapışkan özellikleri. Onlar ticari ürünler ¹⁷ haline gelmeden önce Ancak, bu güne kadar hala ele alınması gereken konular vardır.

Burada, bir bitki-türevi yapıştırıcı molekülü, tanik asit (TA), ve bir biyo-inert bir polimer poli (etilen glikol) (PEG) arasındaki moleküller arası hidrojen bağları yoluyla hazırlanır BANT da adlandırılır tutkal tamamen yeni türden bir rapor Adından da anlaşılacağı gibi. TA yayg bitkilerin ikincil metabolizma sırasında bulunan temsili hidrolize olabilen tanen olduğunu. Bu, anti-mutajenik ve anti-kanserojen özellikleri nedeniyle, anti-oksidan çok ilgi çekmektedir ve poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) ve poli (N birçok polimer ile supramoleküler etkileşimlerine dahil olduğu gösterilmiştir - vinilpirolidon) (PVPON), katman-katman (Lbl) filmleri ^18-20 ve ilaç salan mikrokapsüller ^21-23 oluşturulur. Bu çalışmada, biz ta verimli bir şekilde hareket edebilir keşfetmeksuya dayanıklı yapıştırıcı fonksiyonel kısım, TAPE tıbbi yapıştırıcı oluşturmak için. Ta basit karıştırma ile, non-kirlenme polimeri, PEG ile supramoleküler yapışkan hale 2.5 kat ticari fibrin yapıştırıcı ile karşılaştırıldığında artan yapışma gücü ve bu yapışma da suyun varlığında, bağlanma ve ayrılma kadar 20 döngü boyunca devam edildi . Onun hemostatik yeteneği in vivo bir karaciğer kanaması modeli üzerinde test edilmiş ve birkaç saniye içinde kanamayı durdurmak için iyi bir hemostatik yeteneğini gösterdi. TAPE biyo-esinlenmiş yaklaşımlarla mevcut sorunlarının sakıncaları çözme içine yeni anlayış ortaya çıkarabilir ilk bitkisel kaynaklı yapıştırıcı olarak ilgili alandaki önemli bir anlamı vardır. Biz de nedeniyle basit hazırlama yöntemi, ölçeklenebilirlik, ayarlanabilir biyodegradasyon oranı gibi muko-yapıştırıcılar, ilaç salan yamalar, yara bakımı pansuman, ve diğerleri gibi tıp ve eczacılık uygulamalarında çeşitli TAPE yaygın kullanımını bekliyoruz yanı sıra yüksek ıslak dayanıklı Kuvvetli Yapıştırıcıiyon özellikleri.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve deneyler KAIST (Bilim ve Teknoloji Kore İleri Enstitüsü) tarafından sağlanan etik protokolü IRB (Institutional Review Board) göre yapılır.

1. ŞERİT Oluşumu

1. Bir ta çözelti hazırlamak için, bir manyetik karıştırıcı üzerinde 4 mi boyutlu bir cam şişe yerleştirin ve bir karıştırma çubuğuna sahip olan damıtık su 1 ml. şişeye tannik asit 1 gr ve daha fazla 1 saat süre ile, 200 rpm'de hafif karıştırma ile su içinde çözülür. TA, tamamen çözülür, karışım, kahverengi bir renk ile şeffaf hale gelir.
2. beyaz bir bulamaç yapmak için birkaç saniye girdap oluşturarak karıştırılarak damıtılmış su, 1 ml, ardından, PEG tozu, 1 g (4-kol, 10 kDa, ve doğrusal, 4.6 kDa) ilave edilerek, bir PEG solüsyonu hazırlayın. 10 dakika boyunca, 60 ° C'de kuluçka, bu bulamacın tutun. Beyaz bir tamamen berrak hale gelinceye kadar.
   NOT: 10 kDa molekül ağırlığına sahip PEG erime noktası yaklaşık 55 olan- 60 ° C ve 4 kDa bir 53 olan - 58 ° C. 1 g kadar suda PEG yüksek bir konsantrasyon / ml berrak çözelti olarak elde edilebilir, böylece erimiş PEG suyla karışabilen olur. berrak bir PEG çözeltisi yüksek bir sıcaklıkta oluşturulduktan sonra, çözelti hala soğutulduktan sonra oda sıcaklığında stabildir.
3. PEG 329 ul ekle (4-kol, 10 kDa) çözeltisi 4.6 kDa olan bir doğrusal PEG durumunda adım 1.1 hazırlanan ta çözeltisi (1.2 671 ul bir PEG çözeltisi 311 ul ekleyin aşamasında hazırlanan bir mikro santrifüj tüpüne bir TA çözelti) 689 ul. Yavaşça homojen onları karıştırmak için dar bir spatula ile iki viskoz ve bal gibi çözümler karışır.
   DİKKAT: Her iki çözüm de oldukça viskoz, böylece bilim adamı yavaş ama yeterince yukarı çekin ve bir mikropipet ile çözüm aktarmanız gerekir.
4. sabit açılı rotor ile donatılmış bir santrifüjü içinde 3 dakika boyunca 12.300 x g'de adım 1.3 elde edilen karışım dönerler.
5. dikkatle rembir mikropipet kullanarak mümkün olduğunca süpernatant kadar ove ve aşağı yerleşti ürünü toplamak: Bu tam olarak oluşmuş BANT olduğunu. . BANT oluştuktan sonra buzdolabında saklayın - birkaç hafta NOT (4 8 ° C): BANT gama radyasyonu ya da cerrahi uygulamalarda kullanım öncesi elektron ışın tedavisi ile sterilize edilebilir.

TAPE yapışması Mukavemet 2. ölçümü

1. Cilt dokusu üzerinde, tüm yağ çıkardıktan sonra biopsi darbe ucu ile kesilerek 6 mm bir çapa sahip olan domuz derisi doku iki adet hazırlayın.
   NOT: domuz deri dokusu sağlıklı domuz yan cilt elde edilmiştir ve Güney Kore Daejeon bulunan yerel et piyasadan satın alındı.
2. Her bir doku dış tarafına ticari siyanoakrilat yapıştırıcı uygulanır ve metal çubuk dokusu ekleyin.
   NOT: Metalik çubuk ek tanıtıcı yani dokular olarak kullanılırdoğrudan makine tarafından kavradı değil yeniden. Bu duruma göre, bu çekme makinesinin konfigürasyonunun aşağıdaki diğer malzemeler ile değiştirilebilir.
3. dokuda bir tarafında - TAPE bir damla uygulayın (6 mg TAPE bir damla yaklaşık 3). Daha sonra, Şekil 2A'da görüldüğü gibi, bağlı oldukları şekilde eşit kendi iç tarafında iki doku arasındaki bir doku kullanılarak TAPE yayıldı.
4. Daha sonra el homojen karıştırın ve her doku ve TAPE arasındaki arayüzü en üst düzeye çıkarmak için birkaç kez takın ve dokuların iki tarafı ayırmak.
5. UTM ile çubuğun dikkatle kavrama her yan. yapışma gücü TAPE bağlı iki doku ayırmak için gereken kuvvet ile belirlenecektir. İlk olarak, 1 dakika için 20 N'luk bir kuvvet uygulanır. Daha sonra, makine ile, 1 mm / dakika arasında bir oranda bir karşı yönde her çubuk çekin. kadar dokular tamamen ayrılır.
   NOT: Veriler bir kuvvet-mesafe olarak verilecektir (FD) eğrisi hareketi tarafından tespitHer bir çubuğun.
6. Yani, numune yüzey alanının adım 2.5 elde FD eğrisi gösterilen maksimum kuvvet (kN) bölünmesi ile TAPE yapışma gücünü hesaplamak, 3.14 x (0.003 m) ^2.
7. suyun mevcudiyetinde yapışma gücünü kontrol için iki doku arasındaki ayrılmış alanda eden 20 ul ve hemen takın. makine ile, yine sıyrılma testi gerçekleştirin.

3. İn Vitro Parçalanma Testi

1. Mikro santrifüj tüpünün bir kapak (D = 8 mm) kesilmiş ve W, _C olarak tanımlamak için kapağı tartın.
2. TAPE 150 mg kapağını doldurun ve ₀ W toplam başlangıç ​​ağırlığı olarak ayarlamak için tekrar hep birlikte tartın.
   DİKKAT: kap TAPE aşırı yüklemeyin. Bu adım 3.4 inkübasyon sırasında karıştırma işleminin elde edilen PBS tamponu akımı için fiziksel bir engel olması gibi TAPE yüksekliği, başlığın üst daha düşük olmalıdır.
3. Bir hücre kültür şişesi içine bant içeren kap koyun (75 ^cm2), ve PBS tampon maddesi 50 ml (1 x, pH 7.4), hücre kültürü şişesine kapağa bandın tam olarak PBS tamponu batırılır, eklemek Şekil 3A'da gösterilen (n = 5).
4. yumuşak karıştırma (50 rpm) ile fizyolojik koşullara benzer bir 37 ° C, orbital bir çalkalama inkübatöründe aşama 3.3'te hazırlanan hücre kültürü şişesi, inkübe edin.
   DİKKAT: 50 rpm'de karıştırma durumu tutun. Yüksek devir TAPE bir çöküş neden olabilir.
5. Her zaman noktasında, hücre kültürü şişesi TAPE kap almak ve daha sonra azot gazı üflenerek kurutun. Kalan TAPE içeren kap tartılır. W _t her zaman noktasında ağırlığını ayarlayın. Tekrar taze PBS değiştirin ve her zaman noktasında W _t ölçme sonra tekrar sallayın.
6. göreli kalan ağırlık (%) aşağıdaki denklem hesaplayın.
   Nispi kalan ağırlık (%) = (W _t - W, _C) / (B ₀ - W, _C) x 100%

TAPE 4. Hemostatik yeteneği

NOT: Tüm hayvan deneyleri Sağlık ve Refah Kore Bakanlığı tarafından sağlanan yönergelere ve etik protokole uygun olarak yapılmalıdır.

1. Ref ²⁴ tarif edildiği gibi in vivo hemostatik yeteneğini değerlendirmek için, kanayan fare karaciğer modeli inceleyin.
2. (Grup başına n = 5) tiletamine-zolazepam (33,333 mg / kg) ve ksilazin (7,773 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile - beş fareleri (erkek 35 g, normal bir ICR fare, 6 hafta, 30) anestezisi. Uygun anesthetization doğrulamak için, hayvanın pençe hafifçe tutam ve hiçbir hareket hayvan cerrahisi yapmak için yeterli anestezi olduğunu gösterir vb, pençe çekilmesi gibi hareketleri gözlemleyin.
3. , Hayvanın gözlerinin kuruluğunu önlemek bir altında yeterince süre gözlerine veteriner merhem uygulamak içinestezia. orta hat insizyon yoluyla karaciğer Açığa ve kanama ikna etmek için bir 18 G iğne ile karaciğer delin.
4. steril gazlı bez ile akan kanın çıkarın ve kanama sitesinde hemen TAPE veya fibrin yapıştırıcı (pozitif kontrol) 100 ul koydu.
   NOT: Daha başka sütür nedeniyle yara dokuları üzerinde çok kan dayanıklı yapıştırıcı özellikleri TAPE uygulandıktan sonra ihtiyaç vardır. Negatif kontrol için, bir tedavi kanama bölgesinde meydana gelir.
5. Her durumda, hasar sitesinden kan toplamak için karaciğer altına bilinen kütleye sahip bir filtre kağıdı koyun. Taze bir 4 kez her 30 saniye (yani., 2 dk) ile kağıdı değiştirin.
6. her 30 saniyede toplanan her filtre kağıdı üzerinde emilen kan kitle ölçün. Hayvan deneyden sonra, CO ₂ boğulma ötenazi yoluyla fareler kurban.

Sonuçlar

1 lik hacim oranında (Şekil 1A): BANT TA (1 ug / ml damıtılmış su içinde) ve 2 PEG (1 ug / ml damıtılmış su içinde) içeren iki sulu solüsyonun karışımını santrifüjden sonra yerleşir bir supramoleküler toplamıdır. karışım oranı yüksek yapışma mukavemeti ulaşmada önemli bir faktördür; BANT 2 ile oluşturulur: 1 olduğunda karıştırma oranında, ta 25 adet hidroksil grubu (-OH) ile 20 tane fazla en yüksek moleküller arası hidrojen ba?...

Tartışmalar

Bir bitkiden türetilmiş polifenolik bileşik, TA suya dayanıklı moleküler etkileşim esinlenerek hemostatik yapıştırıcı adlı TAPE tamamen yeni bir sınıf gelişti. TA belirgin nedeniyle, anti-oksidan, anti-bakteriyel, anti-mutajenik ve anti-kanserojen özellikleri dikkat çekti temsili hidrolize olabilen tanen olduğunu.

herhangi bir başka kimyasal sentetik prosedürler olmadan santrifüj ardından iki sulu çözeltilerin sadece bir adım karıştırma gibi TAPE yapma süreci, s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tannic acid	Sigma-aldrich	403040
Poly(ethylene oxide), 4-arm, hydroxy terminated	Aldrich	565709	Averge Mn ~10,000
Poly(ethylene glycol)	Aldrich	373001	Average Mn 4,600
Biopsy punch	Miltex	33-36	Diameter = 6 mm
Aron Alpha®	Toagosei Co., Ltd.		Instant glue
Universal testing machine (UTM)	Instron	5583
Microcentrifuge tubes	SPL life science	60015	1.5 mL
Petri dish	SPL life science	10090	90 x 15 mm
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	1x PBS ingredient
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S5136	1x PBS ingredient
Sodium chloride	Duchefa biochemie	S0520.5000	1x PBS ingredient
Incubating shaker	Lab companion	SIF6000R
ICR mice	Orient bio	Normal ICR mouse	6 weeks, 30-35 g, male
Tiletamine-zolazepam (Zoletil 50)	Virbac
Zylazine (Rompun)	Bayer
PrecisionGlideTM needle (18 G)	BD	302032	18 G
Filter paper	Whatman	1001 125	Diameter = 125 mm
Parafilm	Bemis Flexible Pakaging	PM996