调查Coronin A在早期饥饿反应中的作用<em&gt;粘菌</em&gt;通过聚集测定

摘要

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

摘要

粘菌变形虫发现于土壤中，对细菌为食。当食物来源变得稀少，它们分泌的因素来启动多发展计划，在此期间，单个细胞对聚集中心，趋化^1-4。这个过程是依赖于环磷酸腺苷（cAMP）的⁵的释放。 Camp在波通过腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的一致行动产生的，结合G蛋白偶联受体的cAMP ^6,7。一种广泛使用的测定法来分析所涉及的低等真核生物粘菌的发育周期的机制是基于细胞聚集在浸没条件^8,9的观察。这个协议描述coronin A在发育周期的作用的分析通过饥饿在平衡盐溶液^（BSS）10浸没组织培养板中。 Coronin A是广泛保守的PR的一员otein家人已经在各种各样的活动^11,12牵连coronins的。缺乏coronin一盘基网柄细胞不能形成多聚集，而这个缺陷可以通过提供的cAMP脉冲，这被救出的coronin上游A行为cAMP的级联^10。在这些研究中所描述的技术提供了强大的工具中粘菌的cAMP的级联的上游发育周期的初始阶段进行调查的蛋白质的功能。因此，利用这种聚集试验可允许coronin函数的进一步研究和推进我们coronin生物学的理解。

引言

蛋白质的coronin家族是高度整个真核生物保守的。这些蛋白由氨基末端色氨酸天冬氨酸（WD）区域，随后由连接到羧基端卷曲螺旋结构域^13,14独特区域含有重复-（ 图1）的存在为特征。 Coronins已牵涉多种细胞功能，包括细胞骨架调节和信号转导^12。在哺乳动物中，多达六个短coronin分子（coronin 1-6）以及一个"串联"coronin 7，可共表达^12,15。 Coronin 1是最广泛研究的家族成员，并且显示是参与病原体的破坏，T细胞存活和神经信号。怎么样，究竟coronin 1进行这些活动仍不清楚。而coronin 1所示调节^的 Ca ²⁺和信令依赖cAMP的-以及F-肌动蛋白细胞骨架调制^16-18中，潜在的共同在哺乳动物中最多7家族成员的-expression使得它具有挑战性的研究coronins的分子功能在这些系统中，由于潜在的冗余。不同于哺乳动物的有机体中，低等真核生物粘菌表示只有两个coronin家庭成员（coronin A，哺乳动物coronin 1和coronin B的同源基因，哺乳动物coronin 7的直系同源基因）显然与非冗余功能^15,19,20。这一事实使粘菌一种强效的模型来研究coronins的功能。

研究coronin A在粘菌中的作用，我们通过在含有用野生型的细胞或细胞缺乏coronin ¹⁰平衡盐溶液（BSS）缓冲组织培养板饥饿诱导的发展周期。我们发现，缺乏coronin A细胞无法形成在饥饿的多细胞聚集体。对于这种表型的的准确定量评估在本协议中所述的自动化活细胞成像是一个重要的工具。在缺乏coronin A细胞早期饥饿反应开始时的缺陷可以通过提供的cAMP脉冲，表明coronin内cAMP级联的上游A行为解救。 cAMP的脉冲的外源应用到模拟发展的起始在过去^8,9被利用由几个实验室。然而，这个过程也被称为是高度依赖于细胞密度和定时。因此，这里描述的方案的目的是减少以保证高度的重现性，这些变异。两者合计，在这些研究中所使用的技术提供了强大的工具中粘菌的发育周期的早期阶段，以调查蛋白质的功能和必须识别向上以及coronin函数的下游效应的潜力。

研究方案

1. 通过观察时间推移显微镜粘菌的早期饥饿反应。
   1. 生长DH1.10细胞或CORA缺陷细胞在Erlenmayer烧瓶含有HL-5培养基（对于1升:5克蛋白胨，5克thiotoneë胨10克葡萄糖，5克酵母提取物0.35克Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O，0.35克KH ₂ PO _4，0.05g的双氢硫酸盐，pH值6.6）在22℃与160 rpm的旋转振荡培养箱。保持细胞以0.01×10 ^6个细胞/ ml和2×10 ^6个细胞/ ml之间的密度。
   2. 检验细胞聚集，通过收获对数期生长DH1.10细胞²¹或CORA缺陷细胞在DH1.10背景生成^10，在22℃用HL-5培养基振荡培养生长。这样做，取细胞（通常为10至50毫升）中，离心适量在400 xg离心3分钟，并在BSS（10毫摩尔NaCl，10毫氯化钾洗涤细胞两次，2.5mM的_氯化钙 ，pH值6.5）。
   3. 算使用血球细胞。接着，板细胞以（5，10，20，或40）的密度×10 ^4个细胞/ cm ²在24孔板中。让他们在22℃，在BSS坚持1小时。
   4. ¹⁰如前所述，拍摄图像的每135秒通过可视化时间推移显微镜聚集。使用活细胞成像设置配备5X物镜和由适当的软件自动化的电子倍增电荷耦合器件照相机（见材料数据表 ）。
2. 饥饿时粘菌细胞内cAMP脉冲。
   1. 检查外部施加的cAMP脉冲上DH1.10细胞²¹或DH1.10 CORA缺陷细胞¹⁰的发展的影响，通过收获细胞。这样做，取细胞的适量（通常在10至50毫升）中，离心以400 xg离心3分钟，并在BSS洗涤两次。
   2. 腠nt的细胞使用血细胞计数器和重悬细胞，以在BSS 1×10 ⁷细胞/ ml的密度。施加脉冲之前摇动培养（160转）在​​22℃2小时。添加使用定时器控制蠕动泵的cAMP脉冲。编程泵历时5小时的递送5秒脉冲的15微升50纳米的cAMP（最终浓度）的每6.5分钟。
   3. 算使用血球细胞。随后，镀细胞以（5，10，20，或40）的密度在24孔板×10 ^4个细胞/ cm ^2。允许坚持在BSS 1小时。
   4. 之后用5X客观亮场显微镜在22℃，16小时可视化聚集。
3. 通过暴露于条件培养基粘菌发展的诱导。
   1. 描述²²准备新鲜的条件培养基。收集日志相DH1.10细胞²¹或DH1.10 CORA缺陷细胞^10，颤抖崇拜使用移液管，离心3分钟，在400 XG用HL-5培养基数目字在22℃和洗涤细胞三次PBM（0.02磷酸钾，10μM _氯化钙和1mM MgCl ₂的，pH值6.1）。
   2. 算使用血球细胞，重悬这些在PBM以1×10 ⁷个细胞/ ml的密度，并在110转/ 22℃下摇动20小时。
   3. 收集条件培养基，在400×g下 3分钟离心后，在8000×g下通过离心澄清在4℃15分钟。
   4. 通过0.45微米的过滤器过滤条件培养基（见材料表 ）和PBM稀释三倍。
   5. 算使用血球和板细胞以（5，10，20，或40）的密度×10 ^4个细胞/ cm ²在24孔板中。让他们在22℃下坚持1小时。
   6. 与前面制备的条件培养基的细胞的交换上清液。
   7. 可视化聚集的压脚提升16小时使用5X目标明视场观察。

结果

细胞在coronin一位选秀节目的缺陷在早期发育缺陷（ 图2）。在不存在coronin A细胞都无法形成多细胞聚集体，这是粘菌的发育周期期间的最初步骤。因此，coronin A显示早期饥饿反应和/或cAMP信号中发挥作用。事实上，由于缺乏在没有coronin A的多细胞聚集形成是伴随着减少cAMP信号^10。然而，外源的cAMP脉冲的施加充分恢复野生型表型（ 图3）。

讨论

的coronin蛋白质在真核分支的最类群找到。 粘菌 coronin A，哺乳动物coronin 1的同源物，是参与早期饥饿反应，由于coronin A缺乏的细胞不能够在早期发育，以形成聚集的中心周期^10。为了能够定量和准确地评估在菌株之间发展的延迟，在显微镜活细胞成像设置与自动阶段控制器是一个必不可少的工具。

D.菌在其生命周期^1-4的几个阶段利用cAMP的作为必?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)
Proteose peptone	BD Bioscience	211693
Thiotone E peptone	BD Bioscience	211684
Yeast extract	BD Bioscience	212750
Glucose	AppliChem	A3666
Na2HPO4*2H2O	Fluka	71643
KH2PO4	AppliChem	A1043
dihydrostreptomycin-sulfate	Sigma-Aldrich	D1954000
PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)			self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)			self made
0.45-μm Filtropure S filter	Sarstedt	83.1826
Falcon 24-well Tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1H
Cellobserver microscope	Zeiss		custom built
AxioVision software	Zeiss
IPC Microprocessor–controlled dispensing pump	ISMATEC	ISM 931
Axiovert 135M microscope	Zeiss	491237-0001-000
Incubation Shaker	Inforst HT Minitron