חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של<em&gt; Discoideum Dictyostelium</em&gt; באמצעות אגרגציה מבחנים

Summary

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Abstract

אמבת discoideum Dictyostelium נמצאת באדמה, האכלה על חיידקים. כאשר מקורות המזון הופכים נדירים, הם מפרישים גורמים ליזום תוכנית פיתוח רב-תאיים, במהלכה תאים בודדים chemotax לעבר מרכזי צבירה ^1-4. תהליך זה תלוי בשחרור של monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP) ^5. cAMP מופק בגלים דרך הפעולה המתואמת של cyclase adenylate ו phosphodiesterases, ונקשר לקולטנים cAMP G- חלבון בשילוב ^6,7. Assay בשימוש נרחב כדי לנתח את המנגנונים מעורבים מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium eukaryote הנמוך מבוסס על התצפית של צבירת תא בתנאים שקועים ^8,9. פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של התפקיד של coronin במחזור התפתחותי ברעב צלחות רקמות תרבות שקועה תמיסת מלח המאוזן (BSS) ^10. Coronin A הוא חבר pr נשמרת נרחבהמשפחה otein של coronins כי היו מעורבים במגוון רחב של פעילויות ^11,12. תאים Dictyostelium חסר coronin A הם מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, פגם זה יכול להינצל על ידי אספקת פולסים של cAMP, דבר המצביע על כך coronin מתפקדת במעלה הזרם של cAMP מפל ^10. הטכניקות המתוארות מחקרים אלה מספקים כלים חזקים לחקור פונקציות של חלבונים בשלבים הראשונים של מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium במעלה הזרם של מפל cAMP. לכן, ניצול assay אגרגציה זה עשוי לאפשר מחקר נוסף של coronin פונקציה ולקדם את הבנתנו ביולוגיה coronin.

Introduction

משפחת coronin של חלבונים הוא שמור ביותר ברחבי אאוקריוטים. חלבונים אלה מאופיינים על ידי הנוכחות של אזור אמינו מסוף טריפטופן-aspartate (WD) לחזור המכיל ואחריו אזור ייחודי מחובר לתחום מפותל-סליל carboxy מסוף ^13,14 (איור 1). Coronins היו מעורבים במגוון של תפקודים תאיים, כולל רגולציה cytoskeletal האות התמרה ^12. ביונקים, עד שש מולקולות coronin קצרות (coronin 1-6) וכן 'טנדם' coronin 7, יכולה להיות שותף הביע ^12,15. Coronin 1 הוא בן המשפחה למד בצורה המקיפה ביותר, ו הוצג להיות מעורב הרס הפתוגן, הישרדות תא T ואיתות עצבית. איך, בדיוק, coronin 1 מבצע פעילויות אלה עדיין לא ברורים. בעוד coronin 1 הוצג להסדיר Ca ^{2 +} ו cAMP תלוי איתות וכן F- תקטין cytoskeleton אפנון ^16-18, שיתוף הפוטנציאל-expression של עד 7 בני משפחה ביונקים עשתה זה מאתגר ללמוד את הפונקציה מולקולרית של coronins במערכות אלה, בשל כפילויות פוטנציאליים. בניגוד אורגניזמים יונקים, discoideum Dictyostelium eukaryote נמוך מבטא רק שני בני משפחה coronin (א coronin, את ortholog של B יונקים coronin 1 ו coronin, את ortholog של יונקים coronin 7) עם כנראה לא יתירים פונקציות ^15,19,20. עובדה זו הופכת discoideum Dictyostelium מודל חזק כדי ללמוד את הפונקציה של coronins.

כדי ללמוד את התפקיד של coronin ב discoideum Dictyostelium, אנו מושרה מעגל ההתפתחות ברעב צלחות רקמות תרבות המכילות תמיסת מלח מאוזן (BSS) חיץ או באמצעות תאי סוג ברים או תאים חסרי coronin A ^10. מצאנו כי התאים חסרי coronin לא הצליחו ליצור אגרגטים רבים-תאי על רעב. לקבלת הערכה כמותית מדויקת של פנוטיפ זההדמית תא חייה אוטומטית המתואר בפרוטוקול זה היא כלי חיוני. הפגם בייזום של התגובה רעב מוקדם בתאים חסר coronin A יכול להינצל על ידי אספקת פולסים של cAMP, דבר המצביע על כך coronin מתפקדת במעלה הזרם של מפל cAMP. היישום אקסוגני של פולסים cAMP לדמות לתחילת עבודות הפיתוח נוצל על ידי מספר מעבדות ב ^8,9 בעבר. עם זאת, הליך זה ידוע גם להיות תלוי מאוד צפיפות תא ועיתוי. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן שואף להפחית variabilities הללו על מנת להבטיח רמה גבוהה של שחזור. יחדיו, טכניקות נוצלו במחקרים אלה מספקים כלים חזקים לחקור פונקציות של חלבונים במהלך השלבים המוקדמים של מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium ויש להם את הפוטנציאל לזהות החצים למעלה וכן effectors במורד הזרם של coronin פונקציה.

Protocol

1. שים את התגובה הרעבה מוקדם של discoideum Dictyostelium ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות.
   1. לגדל תאים DH1.10 או תאים -deficient קורה בתוך הבקבוק Erlenmayer המכיל בינוני HL-5 (1 L: 5 גרם proteose peptone, 5 גרם thiotone E peptone, 10 גלוקוז גרם, תמצית שמרים 5 גרם, 0.35 גרם Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, 0.35 גרם KH _{2 4} PO, 0.05 גרם dihydrostreptomycin-סולפט, pH 6.6) בשעה 22 ° C באינקובטור רועד עם סיבוב של 160 סל"ד. שמור התאים בצפיפות בין 0.01 x 10 ⁶ תאים / מ"ל ו -2 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
   2. בדוק צבירת תא, על ידי תאי DH1.10 קצירת יומן פאזיים וגדל ²¹ או תאי -deficient קורה ¹⁰ שנוצרו ברקע DH1.10, גדלים רועדים תרבות עם מדיום HL-5 על 22 מעלות צלזיוס. כדי לעשות זאת, לקחת את הכמות המתאימה של תאים (בדרך כלל בין 10 ל 50 מ"ל), צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG לשטוף את התאים פעמיים BSS (10 mM NaCl, 10 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl _2, pH 6.5).
   3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. כתוצאה מכך, תאי צלחת בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 ⁴ תאים / ² סנטימטר בצלחת 24 גם. לאפשר להם לדבוק עבור שעה 1 ב 22 מעלות צלזיוס BSS.
   4. דמיינו צבירה ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות כפי שתואר קודם לכן ^10, לקחת תמונות כל 135 שניות. באמצעות הדמית תא חי להגדיר מצויד האובייקטיבי 5X ומצלמת מכשיר אלקטרונים-הכפלת תשלום מצמידים אוטומתית את התוכנה המתאימה (ראה לוח חומרים).
2. פועם cAMP של תאים discoideum Dictyostelium במהלך רעב.
   1. לבחון את השפעת פולסים cAMP לשימוש חיצוני על התפתחות תאים DH1.10 ²¹ או תאים -deficient DH1.10 קורה ^10, על ידי איסוף תאים. כדי לעשות זאת, לקחת את הכמות המתאימה של תאים (בדרך כלל בין 10 ל 50 מ"ל), צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG ולשטוף פעמיים BSS.
   2. couNT תאים באמצעות hemocytometer ו resuspend התאים בצפיפות של 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל ב BSS. לנער את תרבויות (160 סל"ד) בשעה 22 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפני יישום קטניות. להוסיף קטניות cAMP באמצעות משאבת peristaltic נשלט טיימר. לתכנת את המשאבה כדי לספק דופק שניות 5 כל 6.5 דקות של 15 μl של 50 ננומטר cAMP (ריכוז סופי) על פני תקופה של 5 שעות.
   3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. בהמשך לכך, צלחת התאים בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 ⁴ תאים / ² ס"מ בצלחת 24 גם. אפשר לדבוק עבור שעה 1 ב BSS.
   4. דמיין צבירה לאחר 16 שעות ב 22 מעלות צלזיוס על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 5X.
3. אינדוקציה של פיתוח discoideum Dictyostelium באמצעות חשיפה בינונית מותנה.
   1. כן בינוני מותנה טרי כמתואר ^22. איסוף תאי יומן פאזיים DH1.10 ²¹ או תאי -deficient DH1.10 קורית ^10, מן רעד כתures עם המדיום HL-5 ב 22 ° C בעזרת פיפטה, צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG ולשטוף תאים שלוש פעמים PBM (0.02 M פוספט אשלגן, 10 מיקרומטר CaCl _2, ו 1 מ"מ MgCl _2, pH 6.1).
   2. ספירת תאים באמצעות hemocytometer, resuspend אלה PBM בצפיפות של 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל ולנער במשך 20 שעות ב 110 סל"ד / 22 מעלות צלזיוס.
   3. אסוף בינוני מותנה לאחר צנטריפוגה ב g 400 × 3 דקות ולהבהיר ידי צנטריפוגה ב 8000 גרם × במשך 15 דקות ב 4 ° C..
   4. מותנה מסנן בינוני דרך פילטר 0.45 מיקרומטר (ראה לוח חומרים) לדלל משולש ב PBM.
   5. ספירת תאים באמצעות hemocytometer צלחת בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 ⁴ תאים / ² ס"מ בצלחת 24 גם. לאפשר להם לדבוק עבור שעה 1 ב 22 מעלות צלזיוס.
   6. supernatant Exchange של תאים עם המדיום המותנה שהוכן קודם לכן.
   7. דמיינו צבירהחרה 16 ​​שעות על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 5X.

תוצאות

תאים חסרים coronin מופע פגם בהתפתחות מוקדמת (איור 2). בהעדר coronin תאים אינם מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, המהווה את הצעד הראשוני במהלך מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium. לכן, coronin ינוגן תפקיד במהלך התגובה הרעבה מוקדם ו / או איתות cAMP. אכן, חוסר הי?...

Discussion

החלבונים coronin נמצאים מינים רוב clade איקריוטיים. Coronin Dictyostelium discoideum, את homologue של יונקים coronin 1, הוא מעורב בתגובה רעב מוקדם, מאז coronin A-לקוי התאים אינם מסוגלים ליצור מרכזי צבירה במהלך המוקדמות התפתחותי מחזור ^10. כדי להיות מסוגל כמותית להעריך נכונת העיכוב בהתפתחות ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)
Proteose peptone	BD Bioscience	211693
Thiotone E peptone	BD Bioscience	211684
Yeast extract	BD Bioscience	212750
Glucose	AppliChem	A3666
Na2HPO4*2H2O	Fluka	71643
KH2PO4	AppliChem	A1043
dihydrostreptomycin-sulfate	Sigma-Aldrich	D1954000
PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)			self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)			self made
0.45-μm Filtropure S filter	Sarstedt	83.1826
Falcon 24-well Tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1H
Cellobserver microscope	Zeiss		custom built
AxioVision software	Zeiss
IPC Microprocessor–controlled dispensing pump	ISMATEC	ISM 931
Axiovert 135M microscope	Zeiss	491237-0001-000
Incubation Shaker	Inforst HT Minitron