初期の飢餓応答でCoronin Aの機能を調査<em&gt;細胞性粘菌</em&gt;凝集アッセイによって

要約

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

要約

細胞性粘菌のアメーバは細菌を餌に、土壌中に発見されています。食料源が不足になると、それらは、単一の細胞が凝集中心^1-4向かっ走化その間多開発プログラムを開始する因子を分泌します。このプロセスは、環状アデノシン一リン酸^（cAMP）5のリリースに依存しています。 cAMPは、アデニル酸シクラーゼ、およびホスホジエステラーゼの協調作用によって電波で産生され、Gタンパク質共役受容体のcAMP ^6,7に結合されています。広く使用されているアッセイは、水没条件^8,9における細胞凝集の観察に基づいている下等真核生物細胞性粘菌の発達サイクルに関与するメカニズムを分析します。このプロトコルは、平衡塩溶液^（BSS）10の中に沈め組織培養プレート中で飢餓によって発達サイクルのcoronin Aの役割の分析を記載します。 Coronin Aは広く保存された広報のメンバーであります活動^11,12の多種多様に関与しているcoroninsの家族otein。coronin Aを欠く細胞性粘菌の細胞は、多細胞凝集体を形成することができない、そしてこの欠陥が上流の行為をcoroninことを示唆し、cAMPのパルスを供給することによって救出することができますcAMPは^10をカスケード。これらの研究に記載された技術は、cAMPカスケードの上流細胞性粘菌の発達サイクルの初期段階中にタンパク質の機能を調べるための強力なツールを提供します。したがって、この凝集アッセイを利用して機能をcoroninのさらなる研究を可能にし、coronin生物学の我々の理解を進めることができます。

概要

タンパク質のcoroninファミリは、高度真核生物を通じて保存されています。これらのタンパク質は、カルボキシ末端のコイルドコイルドメイン^13,14（ 図1）に接続されたユニークな領域が続くアミノ末端トリプトファン、アスパラギン酸（WD）リピート含有領域が存在することを特徴とします。 Coroninsは、細胞骨格調節およびシグナル伝達^12を含む、種々の細胞機能に関与しています。哺乳類では、最大6つの短いcoronin分子（coronin 1-6）と同様に7をcoronin「タンデム」は^、12,15を共発現させることができます。 Coronin 1は、最​​も広く研究ファミリーのメンバーであり、病原体の破壊、T細胞の生存および神経伝達に関与することが示されました。どのように、正確に、coronin 1は、これらの活動は不明なままで行います。 coroninながら1は、CAを調節することが示さ²⁺およびcAMP依存性シグナル伝達だけでなく、F-アクチン細胞骨格の調節^16-18、潜在的な共同ました哺乳類で最大7家族の-expressionは、それが困難なこれらのシステムにcoroninsの分子機能を研究するために潜在的な冗長性のために作られました。哺乳類の生物とは異なり、下等真核生物細胞性粘菌は明らかに非冗長機能^15,19,20と2つだけcoronin家族（coroninのA、哺乳類coronin 1とcoronin Bのオルソログ、哺乳類coronin 7のオルソログ）を表します。この事実は、 細胞性粘菌に coroninsの機能を研究するための強力なモデルになります。

細胞性粘菌でcoronin Aの役割を研究するために、我々は^、10 coronin欠く野生型細胞または細胞のいずれかを用いて平衡塩類溶液（BSS）緩衝液を含む組織培養プレート中で飢餓によって発達サイクルを誘導しました。私たちはcoronin Aを欠く細胞が飢餓時に多細胞凝集体を形成することができなかったことがわかりました。この表現型の正確な定量的評価のためのこのプロトコールに記載の自動化生細胞イメージングは​​不可欠なツールです。 coronin欠く細胞における早期の飢餓応答の開始における欠陥は、cAMPカスケードの上流の行為をcoroninことを示唆し、cAMPのパルスを供給することによって救出することができます。開発の開始をシミュレートするためのcAMPパルスの外因性の適用は、過去^8,9にいくつかの研究室で利用されてきました。しかしながら、この手順は、細胞密度及びタイミングに大きく依存することが知られています。したがって、ここで説明するプロトコルは、再現性の高い度合いを保証するために、これらの変動性を低減することを目的とします。まとめると、これらの研究に利用技術は、 細胞性粘菌の発達サイクルの初期段階でのタンパク質の機能を調査するために強力なツールを提供し、アップ識別だけでなく、機能をcoroninの下流エフェクター可能性を秘めています。

プロトコル

1. タイムラプス顕微鏡による細胞性粘菌の早期の飢餓応答を観察します。
   1. 5グラムプロテオースペプトン、5グラムthiotone Eペプトン、10gのグルコース、5gの酵母エキス、0.35グラムHPO _{4 2}のNa：DH1.10細胞またはHL-5培地（1L用を含むエルレンマイヤーフラスコ中のコーラ欠損細胞成長* 7H ₂ O、0.35グラムのKH 160回転の回転に振盪インキュベーターで22℃で₂ PO _4、0.05グラムジヒドロ-硫酸塩、pHは6.6）。 0.01×10 ⁶細胞/ mlおよび2×10 ⁶細胞/ mlの密度で細胞を保管してください。
   2. 収穫対数期に成長しているDH1.10セル²¹または22℃でのHL-5培地で振とう培養で増殖させたコーラ欠損細胞DH1.10のバックグラウンドで生成された^10、によって、細胞凝集を調べます。これを行うには、400×gで3分間、細胞（通常10〜50 ml）を、遠心分離の適切な量を取り、BSS（10mMの塩化ナトリウム、10mMのKClの中で細胞を2回洗浄、2.5 mMのCaCl ₂を、pHは6.5）。
   3. 血球計数器を用いて細胞を数えます。続いて、（5、10、20、または40）の密度でプレートの細胞を24ウェルプレートに10 ⁴細胞/ ^cm×2。彼らはBSSに22℃で1時間接着させます。
   4. ¹⁰前に説明したように、画像ごとに135秒を取って、タイムラプス顕微鏡により凝集を視覚化します。設定5Xの客観的かつ適切なソフトウェアによって自動化された電子増倍電荷結合素子カメラを搭載したライブセルイメージングを使用して（ 材料表を参照してください）。
2. 飢餓時の細胞性粘菌細胞のcAMPのパルス化。
   1. 外部から細胞を採取することにより、DH1.10細胞²¹またはDH1.10 コーラ欠損細胞¹⁰の開発にcAMPのパルスを適用の効果を調べます。これを行うには、400×gで3分間、適切な細胞の量（通常10〜50ミリリットル）、遠心分離機を取り、BSSで二回洗います。
   2. COUNT血球計数器を用いて細胞やBSSで1×10 ⁷細胞/ mlの密度に細胞を再懸濁します。パルスを印加する前に、2時間22℃で培養（160 rpm）を振ります。タイマー制御蠕動ポンプを使用したcAMPのパルスを追加します。 5時間かけて5秒パルスに50 nMでのcAMP（最終濃度）の15μlのあらゆる6.5分を提供するためにポンプをプログラムします。
   3. 血球計数器を用いて細胞を数えます。続いて、（5、10、20、または40）の密度で細胞をプレート24ウェルプレートに10 ⁴細胞/ ^cm×2。 BSSで1時間接着させます。
   4. 5Xの対物レンズを使用して明視野顕微鏡による22℃で16時間後に凝集を視覚化します。
3. 馴化培地への暴露による細胞性粘菌開発の誘導。
   1. ^22に記載^{されている}よう^に 、新鮮な馴化培地を準備します。カルトを振ってから、対数期DH1.10細胞²¹またはDH1.10 コーラ欠損細胞^10を収集400×gで3分間、ピペット、遠心分離器を用いて22℃でHL-5培地でURESとPBMで細胞を3回洗浄し（0.02 Mリン酸カリウム、10μMのCaCl _2、1mMのMgCl _2、pHは6.1）。
   2. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、mlの1×10 ⁷細胞/の密度でPBMでこれらを再懸濁し、110回転数/ 22℃で20時間振とうします。
   3. 3分間400×gで遠心分離後、馴化培地を収集し、4℃で15分間8000×gで遠心分離することにより明らかにしました。
   4. 0.45μmフィルターを通してフィルター条件培地は、（ 材料表を参照）、PBMで3倍に希釈します。
   5. （5、10、20、または40）の密度で血球計およびプレートを用いて細胞をカウントし、24ウェルプレートに10 ⁴細胞/ ^cm×2。彼らは22℃で1時間接着させます。
   6. 先に調製した馴化培地を用いた細胞の交換上清。
   7. 集約aを可視化5Xの対物レンズを使用して明視野顕微鏡によるFTER 16時間。

結果

ショーを開発の初期段階で欠陥をcoroninにおける欠損細胞（ 図2）。細胞をcoroninの不在下では細胞性粘菌の発達サイクル中の初期段階である多細胞凝集体を形成することができません。したがって、coronin Aは初期の飢餓応答および/またはcAMPシグナル伝達の際に役割を果たしていると思われます。実際、coronin Aの非存在下で、多細胞凝集体形成の欠?...

ディスカッション

coroninタンパク質は、真核生物クレードのほとんどの分類群で発見されています。coronin欠損細胞は初期発生時に集計中心を形成することができないので、 細胞性粘菌の coroninのA、哺乳類coronin 1のホモログは、早期の飢餓応答に関与していますサイクル^10。定量的かつ正確に系統間で開発の遅れを評価することができるようにするには、自動化されたステージコントローラと顕?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)
Proteose peptone	BD Bioscience	211693
Thiotone E peptone	BD Bioscience	211684
Yeast extract	BD Bioscience	212750
Glucose	AppliChem	A3666
Na2HPO4*2H2O	Fluka	71643
KH2PO4	AppliChem	A1043
dihydrostreptomycin-sulfate	Sigma-Aldrich	D1954000
PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)			self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)			self made
0.45-μm Filtropure S filter	Sarstedt	83.1826
Falcon 24-well Tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1H
Cellobserver microscope	Zeiss		custom built
AxioVision software	Zeiss
IPC Microprocessor–controlled dispensing pump	ISMATEC	ISM 931
Axiovert 135M microscope	Zeiss	491237-0001-000
Incubation Shaker	Inforst HT Minitron