La investigación de la función de Coronin A en la temprana respuesta del hambre de<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Los ensayos de agregación por

Resumen

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Resumen

Dictyostelium discoideum amebas se encuentra en el suelo, se alimentan de bacterias. Cuando las fuentes de alimentos se vuelven escasos, secretan factores de iniciar un programa de desarrollo pluricelular, durante el cual las células individuales chemotax hacia los centros de agregación ^1-4. Este proceso es dependiente de la liberación de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) ^5. cAMP se produce en ondas a través de la acción concertada de la adenilato ciclasa y las fosfodiesterasas, y se une a receptores de cAMP acoplados a proteínas G ^6,7. Un ensayo ampliamente utilizado para analizar los mecanismos implicados en el ciclo de desarrollo del menor eucariota Dictyostelium discoideum se basa en la observación de la agregación celular en condiciones sumergidas ^8,9. Este protocolo describe el análisis de la función de coronin A en el ciclo de desarrollo por el hambre en placas de cultivo de tejidos sumergidos en solución salina equilibrada (BSS) ^10. Coronin A es un miembro de la pr ampliamente conservadafamilia Otein de coronins que han sido implicados en una amplia variedad de actividades de ^11,12. Dictyostelium células que carecen de Coronin A no son capaces de formar agregados multicelulares, y este defecto puede ser rescatado por el suministro de pulsos de cAMP, lo que sugiere que Coronin A actúa aguas arriba de la cAMP en cascada ^10. Las técnicas descritas en estos estudios proporcionan herramientas robustas para investigar funciones de las proteínas durante las etapas iniciales del ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum aguas arriba de la cascada de AMPc. Por lo tanto, la utilización de este ensayo de agregación puede permitir el estudio adicional de coronin una función y avanzar en nuestra comprensión de la biología coronin.

Introducción

La familia de proteínas coronin está altamente conservada en todo eucariotas. Estas proteínas se caracterizan por la presencia de un triptófano-aspartato amino-terminal (WD) región seguido de una región única conectado a un dominio espiral de la bobina carboxi-terminal ^13,14 repetir que contienen (Figura 1). Coronins han sido implicados en una variedad de funciones celulares, incluyendo la regulación del citoesqueleto y la transducción de señales ^12. En los mamíferos, hasta seis moléculas cortas coronin (coronin 1-6), así como un 'tándem' coronin 7, se pueden co-expresaron ^12,15. Coronin 1 es el miembro de la familia más ampliamente estudiado y ha demostrado estar implicado en la destrucción de patógenos, la supervivencia de las células T y la señalización neuronal. ¿Cómo, exactamente, coronin 1 lleva a cabo estas actividades aún no está claro. Mientras coronin 1 se muestra para regular Ca2 ⁺ y cAMP-dependiente de señalización, así como F-actina del citoesqueleto de modulación ^16-18, el potencial de co-expresión de hasta 7 miembros de la familia de los mamíferos ha hecho que sea difícil para el estudio de la función molecular de coronins en estos sistemas, debido a las posibles redundancias. A diferencia de los organismos mamíferos, la discoideum eucariota inferior Dictyostelium expresa sólo dos miembros de la familia (coronin coronin A, el ortólogo de mamífero coronin 1 y coronin B, el ortholog de ​​mamíferos coronin 7) con funciones aparentemente no redundantes ^15,19,20. Este hecho hace que Dictyostelium discoideum un modelo potente para estudiar la función de coronins.

Para estudiar el papel de coronin A en Dictyostelium discoideum, se indujo el ciclo de desarrollo por el hambre en placas de cultivo de tejidos que contienen tampón de equilibrado solución salina (BSS) utilizando ya sea células de tipo salvaje o células que carecen de Coronin A ^10. Se encontró que las células que carecen coronin A no fueron capaces de formar agregados multicelulares a la inanición. Para una evaluación cuantitativa exacta de este fenotipo laimágenes de células vivas automatizado descrito en este protocolo es una herramienta vital. El defecto en la iniciación de la respuesta del hambre temprano en las células que carecen Coronin A puede ser rescatado por el suministro de pulsos de cAMP, lo que sugiere que Coronin A actúa aguas arriba de la cascada de AMPc. La aplicación exógena de pulsos de AMPc para simular el inicio del desarrollo ha sido utilizado por varios laboratorios en el pasado ^8,9. Sin embargo, este procedimiento también es conocido por ser dependiente de las densidades de células y el tiempo altamente. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí tiene como objetivo reducir estas variabilidades con el fin de garantizar un alto grado de reproducibilidad. En conjunto, las técnicas utilizadas en estos estudios proporcionan herramientas robustas para investigar funciones de las proteínas durante las primeras etapas del ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum y tienen el potencial de identificar arriba, así como efectores aguas abajo de Coronin una función.

Protocolo

1. Observar la respuesta del hambre a principios de Dictyostelium discoideum por microscopía de lapso de tiempo.
   1. Se cultivan las células o células DH1.10 Cora-deficiente en un erlenmeyer que contiene HL-5 medio (para 1 litro: 5 g de peptona proteosa, 5 g thiotone E peptona, 10 g de glucosa, 5 g de extracto de levadura, 0,35 g de Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, 0,35 g KH ₂ PO _4, 0,05 g dihidroestreptomicina-sulfato, pH 6.6) a 22 ° C en una incubadora de agitación con una rotación de 160 rpm. Mantener las células a una densidad entre 0,01 x 10 ⁶ células / ml y 2 x 10 ⁶ células / ml.
   2. Examinar la agregación de células, las células DH1.10 recolección de registro en fase de crecimiento o ²¹ células con deficiencia de Cora ¹⁰ generada en el fondo DH1.10, que se cultiva en un cultivo agitado con HL-5 medio a 22 ° C. Para ello, tomar la cantidad adecuada de células (por lo general entre 10 y 50 ml), se centrifuga durante 3 minutos a 400 xg y se lavan las células dos veces en BSS (NaCl 10 mM, KCl 10, CaCl 2,5 mM _2, pH 6,5).
   3. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Posteriormente, las células de la placa a una densidad de (5, 10, 20, o 40) x 10 ⁴ células / cm ² en una placa de 24 pocillos. Deje que se adhieran durante 1 hora a 22 ° C en BSS.
   4. Visualizar la agregación mediante microscopía de lapso de tiempo como se describe antes de las ^10, tomando imágenes cada 135 seg. utilizando una imagen de células vivas configurar equipado con el objetivo de 5X y una cámara de dispositivo de carga acoplada electrones multiplicando automatizado por el software apropiado (véase Tabla de Materiales).
2. cAMP pulsante de las células de Dictyostelium discoideum durante la inanición.
   1. Examinar el efecto de los pulsos de cAMP aplicadas externamente en el desarrollo de las células o células DH1.10 ^{21 10} DH1.10 Cora-deficiente, por la recolección de las células. Para ello, tomar la cantidad adecuada de células (por lo general entre 10 y 50 ml), se centrifuga durante 3 minutos a 400 xg y lavar dos veces en BSS.
   2. Coucélulas nt utilizando un hemocitómetro y volver a suspender las células a una densidad de 1 x 10 ⁷ células / ml en BSS. Agitar las culturas (160 rpm) a 22 ° C durante 2 horas antes de la aplicación de pulsos. Añadir pulsos de cAMP usando una bomba peristáltica controlada temporizador. Programar la bomba para entregar un impulso de 5 segundos cada 6,5 ​​min de 15 l de 50 nM de cAMP (concentración final) durante un período de 5 horas.
   3. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Posteriormente, la placa de las células a una densidad de (5, 10, 20, o 40) x 10 ⁴ células / cm ² en una placa de 24 pocillos. Permitir que se adhieran durante 1 hora en BSS.
   4. Visualizar la agregación después de 16 horas a 22 ° C por microscopía de campo brillante utilizando un objetivo de 5X.
3. La inducción de Dictyostelium discoideum desarrollo a través de la exposición al medio condicionado.
   1. Preparar medio acondicionado fresco como se describe ^22. Recoger las células en fase logarítmica ^DH1.10-21 o células ¹⁰ DH1.10 Cora-deficiente, el temblor de cultoUres con LH-5 medio a 22 ° C utilizando una pipeta, se centrifuga durante 3 minutos a 400 xg y lavar las células tres veces en PBM (0,02 M de fosfato de potasio, 10 mM _{de CaCl2} y _MgCl2 1 mM, pH 6,1).
   2. Recuento de células utilizando un hemocitómetro, volver a suspender estos en PBM a una densidad de 1 x 10 ⁷ células / ml y agitar durante 20 horas a 110 rpm / 22 ° C.
   3. Recoger el medio acondicionado después de centrifugación a 400 xg durante 3 min y clarificar por centrifugación a 8000 xg durante 15 min a 4 ° C.
   4. Medio de filtro acondicionado a través de un filtro de 0,45 micras (ver Tabla de Materiales) y diluir triple en PBM.
   5. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y la placa a una densidad de (5, 10, 20, o 40) x 10 ⁴ células / cm ² en una placa de 24 pocillos. Deje que se adhieran durante 1 hora a 22 ° C.
   6. Cambio de sobrenadante de las células con el medio acondicionado preparado previamente.
   7. Visualizar la agregación de unaespués de 16 horas por microscopía de campo brillante utilizando un objetivo de 5X.

Resultados

Las células deficientes en coronin Un espectáculo de un defecto en el desarrollo temprano (Figura 2). En ausencia de Coronin A las células no son capaces de formar agregados multicelulares, que es el paso inicial durante el ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum. Por lo tanto, coronin A parece jugar un papel durante la respuesta del hambre temprano y / o la señalización de cAMP. De hecho, la falta de formación de agregados multicelulares en ausenc...

Discusión

Las proteínas Coronin se encuentran en la mayoría taxones del clado eucariota. Dictyostelium discoideum coronin A, el homólogo de coronin de mamíferos 1, está implicado en la respuesta del hambre temprano, ya Coronin A-deficiente células no son capaces de formar centros de agregación durante el temprano desarrollo ciclo de ^10. Para poder evaluar cuantitativamente y con precisión el retraso en el desarrollo entre las cepas, un microscopio de imágenes de células vivas puesta a punto con el co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)
Proteose peptone	BD Bioscience	211693
Thiotone E peptone	BD Bioscience	211684
Yeast extract	BD Bioscience	212750
Glucose	AppliChem	A3666
Na2HPO4*2H2O	Fluka	71643
KH2PO4	AppliChem	A1043
dihydrostreptomycin-sulfate	Sigma-Aldrich	D1954000
PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)			self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)			self made
0.45-μm Filtropure S filter	Sarstedt	83.1826
Falcon 24-well Tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1H
Cellobserver microscope	Zeiss		custom built
AxioVision software	Zeiss
IPC Microprocessor–controlled dispensing pump	ISMATEC	ISM 931
Axiovert 135M microscope	Zeiss	491237-0001-000
Incubation Shaker	Inforst HT Minitron