Die Untersuchung der Funktion von Coronin A in der frühen Starvation Reaktion von<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Durch Aggregationstests

Zusammenfassung

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Zusammenfassung

Dictyostelium discoideum Amöbe sind im Boden und ernähren sich von Bakterien gefunden. Wenn Nahrungsquellen knapp werden, sie Faktoren absondern einen vielzelligen Entwicklungsprogramm zu initiieren, in denen ^1-4 einzelne Zellen chemotax zur Aggregation Zentren. Dieser Prozess ist abhängig von der Freisetzung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) ^5. cAMP wird in Wellen durch die konzertierte Aktion der Adenylatcyclase und Phosphodiesterasen produziert und bindet an G - Protein-gekoppelten Rezeptoren cAMP ^6,7. Ein weit verbreiteter Test die Mechanismen in dem Entwicklungszyklus des niederen Eukaryoten Dictyostelium discoideum beteiligt zu analysieren ist in submersen Bedingungen ^8,9 auf der Beobachtung der Zellaggregation basiert. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der Rolle von Coronin A im Entwicklungszyklus durch Verhungern in Gewebekulturplatten unter Wasser in ausgewogener Salzlösung (BSS) ^10. Coronin A ist ein Mitglied der weitgehend konservierten protein Familie von Coronine , die ^11,12 in einer Vielzahl von Aktivitäten eine Rolle spielen . Dictyostelium Zellen ohne A Coronin sind unfähig mehrzelligen Aggregate zu bilden, und dieser Fehler kann durch Zuführen von Pulsen von cAMP gerettet werden, was darauf hindeutet , dass eine Akte stromaufwärts von der Coronin cAMP Kaskade ^10. Die Techniken , die in diesen Studien beschriebenen liefern robuste Werkzeuge Funktionen von Proteinen während der Anfangsstadien des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum stromauf der cAMP - Kaskade zu untersuchen. Daher erlauben die weitere Untersuchung der Coronin Eine Funktion und unser Verständnis der Biologie Coronin kann diese Aggregation Assay verwendet.

Einleitung

Die Coronin Familie von Proteinen ist stark in ganz Eukaryoten konserviert. Diese Proteine ​​werden durch die Gegenwart eines Amino-terminalen Tryptophan-aspartat (WD) wiederholen haltigen Bereich , gefolgt von einer einzigartigen Region verbunden mit einem carboxy-terminalen coiled-coil Domäne ^13,14 (Figur 1) charakterisiert. Coronine wurden in einer Vielzahl von zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Zytoskelett - Regulation und Signaltransduktion ^12. Bei Säugetieren bis zu sechs kurze Coronin Moleküle (Coronin 1-6) sowie ein "Tandem" Coronin 7 können coexprimiert ^12,15 werden. Coronin 1 ist das am intensivsten untersuchten Familienmitglied und wurde pathogen Zerstörung, T-Zell-Überleben und die neuronalen Signalübertragung beteiligt werden gezeigt. Wie genau Coronin 1 trägt diese Aktivitäten aus, bleibt unklar. Während Coronin 1 wurde gezeigt , Ca ²⁺ und cAMP-abhängige Signalgebung sowie F-Aktin - Zytoskelett Modulation ^16-18, das Potential co zu regulieren-Ausdruck von bis zu 7 Familienmitglieder in Säugetieren hat es schwierig, das Molekular Funktion Coronine in diesen Systemen zu untersuchen, aufgrund potentieller Redundanzen. Im Gegensatz zu Säugetierorganismen exprimiert die niederen Eukaryoten Dictyostelium discoideum nur zwei Coronin Familienmitglieder (Coronin A, das Ortholog von Säugetier Coronin 1 und Coronin B, das Ortholog von Säugetier Coronin 7) mit scheinbar nicht-redundante Funktionen ^15,19,20. Diese Tatsache macht Dictyostelium discoideum ein starkes Modell , um die Funktion von Coronine zu studieren.

Um die Rolle von Coronin A in Dictyostelium discoideum studieren, induziert wir den Entwicklungszyklus durch Verhungern in Gewebekulturplatten mit ausgeglichener Salzlösung (BSS) Puffer entweder Wildtyp - Zellen oder Zellen mit fehlenden A ¹⁰ Coronin. Wir fanden heraus, dass Zellen ohne Coronin A waren nicht in der Lage mehrzelligen Aggregate auf Hunger zu bilden. Für eine genaue quantitative Beurteilung dieser Phänotyp derautomatisierte Live Cell Imaging in diesem Protokoll beschrieben ist ein wichtiges Instrument. Der Defekt in der Einleitung des frühen Verhungern Reaktion in Zellen Coronin A fehlt, kann durch Zuführen von Pulsen von cAMP gerettet werden, was darauf hindeutet, dass eine Akte vor der cAMP-Kaskade Coronin. Die exogene Applikation von cAMP Impulse für die Einleitung der Entwicklung zu simulieren wurde von mehreren Laboratorien in der Vergangenheit ^8,9 verwendet worden. Jedoch ist dieses Verfahren auch in hohem Maße von Zelldichten und den Zeitpunkt bekannt sein. Daher beschrieben das Protokoll hier zum Ziel, diese Variabilitäten zu reduzieren, um ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Zusammengenommen sind die verwendeten Techniken in diesen Studien liefern robuste Werkzeuge Funktionen von Proteinen während der frühen Phasen des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum zu untersuchen und haben das Potenzial , zu identifizieren Up- sowie Downstream - Effektoren einer Funktion Coronin.

Protokoll

1. Beachten Sie die frühen Hunger Reaktion von Dictyostelium discoideum durch Zeitraffer-Mikroskopie.
   1. Wachsen DH1.10 Zellen oder CORA - defizienten Zellen in einem Erlenmeyerkolben, der HL-5 - Medium (für 1 L: 5 g Proteosepepton, 5 g thiotone E Pepton, 10 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 0,35 g Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, 0,35 g KH ₂ PO _4, 0,05 g Dihydrostreptomycin-Sulfat, pH 6,6) bei 22 ° C in einem Schüttelinkubator mit einer Rotation von 160 Umdrehungen pro Minute. Halten Zellen mit einer Dichte zwischen 0,01 x 10 ⁶ Zellen / ml und 2 x 10 ⁶ Zellen / ml.
   2. Untersuchen Zellaggregation durch Ernte log-Phase wachsende Zellen DH1.10 ²¹ oder CORA - defizienten Zellen ¹⁰ im Hintergrund DH1.10 erzeugt wird , bei 22 ° C in Schüttelkultur mit HL-5 - Medium gezüchtet. Um dies zu tun, nehmen Sie entsprechende Menge an Zellen (in der Regel zwischen 10 und 50 ml), Zentrifuge 3 min bei 400 xg und waschen Sie die zweimal Zellen in BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl _2, pH 6.5).
   3. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Anschließend Platten Zellen bei einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 ⁴ Zellen / cm ² in eine 24-Well - Platte. Damit sie für 1 h bei 22 ° C in BSS zu haften.
   4. Visualisieren Sie die Aggregation von Zeitraffer-Mikroskopie wie vor ¹⁰ beschrieben, Bilder alle 135 sec nehmen. unter Verwendung der entsprechenden Software automatisiert eine Live - Cell - Imaging eingerichtet , ausgestattet mit 5X Objektiv und einer Elektronenvervielfachungs charge-coupled device - Kamera (siehe Materialien Tabelle).
2. cAMP Pulsieren von Dictyostelium discoideum Zellen während der Hungertod.
   1. Untersuchen die Wirkung von außen aufgebrachten cAMP Impulse auf die Entwicklung von Zellen DH1.10 ²¹ oder DH1.10 CORA - defizienten Zellen ^10, durch die Zellen zu ernten. Um dies zu tun, nehmen Sie entsprechende Menge an Zellen (in der Regel zwischen 10 und 50 ml), Zentrifuge 3 min bei 400 xg und waschen zweimal in BSS.
   2. count - Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Resuspendieren der Zellen zu einer Dichte von 1 x 10 ⁷ Zellen / ml in BSS. Schütteln der Kulturen (160 rpm) bei 22 ° C für 2 Stunden vor der Anwendung von Impulsen. In cAMP Impulse mit einer Zeitschaltuhr gesteuert peristaltische Pumpe. alle 6,5 Minuten von 15 ul 50 nM cAMP (Endkonzentration) über einen Zeitraum von 5 Stunden zu liefern Programmieren Sie die Pumpe mit einem 5 s Puls.
   3. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Anschließend wird die Platte , die Zellen in einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 ⁴ Zellen / cm ² in eine 24-Well - Platte. Lassen Sie für 1 Stunde in BSS einzuhalten.
   4. Visualisieren Aggregation nach 16 Stunden bei 22 ° C von Hellfeld-Mikroskopie ein 5fach Ziel verwenden.
3. Die Induktion von Dictyostelium discoideum Entwicklung durch den Zugang zu konditionierten Medium.
   1. Bereiten Sie frisch konditioniertes Medium als ²² beschrieben. Sammeln Sie log-Phase DH1.10 Zellen ²¹ oder DH1.10 CORA - defizienten Zellen ^10, von Kult Schüttelnmen mit HL-5 - Medium bei 22 ° C mit einer Pipette, Zentrifuge für 3 min bei 400 xg und wasche die Zellen dreimal in PBM (0,02 M Kaliumphosphat, 10 & mgr; M CaCl ₂ und 1 mM MgCl _2, pH 6.1) verwendet wird .
   2. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers resuspendieren diese in PBM in einer Dichte von 1 x 10 ⁷ Zellen / ml und schüttle 20 Stunden bei 110 rpm / 22 ° C.
   3. Sammeln konditionierten Medium nach der Zentrifugation bei 400 × g für 3 min und Klärung durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min bei 4 ° C.
   4. Filter konditionierte Medium durch ein 0,45 - um - Filter (siehe Materialien Tabelle) und dreifach in PBM verdünnen.
   5. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Platte bei einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 ⁴ Zellen / cm ² in eine 24-Well - Platte. Damit sie für 1 h bei 22 ° C zu halten.
   6. Wechselüberstand der Zellen mit dem vorher konditionierten Medium hergestellt.
   7. Visualisieren Aggregation einN ach 16 Stunden von Hellfeld-Mikroskopie ein 5fach Ziel verwenden.

Ergebnisse

Die Zellen einen Mangel an einer Show einen Defekt in der frühen Entwicklung Coronin (Abbildung 2). In Abwesenheit von A - Zellen nicht in der Lage Coronin mehrzellige Aggregate zu bilden, die der erste Schritt während des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum ist. Daher erscheint Coronin A eine Rolle während der frühen Hungerantwort und / oder cAMP-Signalisierung zu spielen. Tatsächlich ist das Fehlen von mehrzelligen Aggregatbildung in Abwesenhe...

Diskussion

Die Coronin Proteine ​​werden in den meisten Taxa der eukaryotischen Klade. Dictyostelium discoideum Coronin A, das Homolog von Säuger Coronin 1, gefunden wird im frühen Verhungern Antwort beteiligt, da Coronin A-defizienten Zellen Aggregationsstellen nicht in der Lage sind , während der frühen Entwicklungs zu bilden Zyklus ^10. Um in der Lage sein, um quantitativ und genau die Verzögerung in der Entwicklung zwischen den Stämmen beurteilen zu können, ein Mikroskop Live Cell Imaging Set-up m...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)
Proteose peptone	BD Bioscience	211693
Thiotone E peptone	BD Bioscience	211684
Yeast extract	BD Bioscience	212750
Glucose	AppliChem	A3666
Na2HPO4*2H2O	Fluka	71643
KH2PO4	AppliChem	A1043
dihydrostreptomycin-sulfate	Sigma-Aldrich	D1954000
PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)			self made
BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)			self made
0.45-μm Filtropure S filter	Sarstedt	83.1826
Falcon 24-well Tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1H
Cellobserver microscope	Zeiss		custom built
AxioVision software	Zeiss
IPC Microprocessor–controlled dispensing pump	ISMATEC	ISM 931
Axiovert 135M microscope	Zeiss	491237-0001-000
Incubation Shaker	Inforst HT Minitron