实时多细胞动力学延长时间推移活体成像在肿瘤微环境

摘要

这个协议描述了使用多光子显微术的实时在单细胞分辨率来执行多细胞相互作用的延长时间推移成像，体内 。

摘要

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

引言

从初级乳腺肿瘤的肿瘤细胞的传播已经显示出不仅涉及肿瘤细胞，但承载间质细胞包括巨噬细胞和内皮细胞。此外，肿瘤血管异常与通透性增加^1。因此，确定如何肿瘤细胞，巨噬细胞和内皮细胞相互作用介导的原发肿瘤微环境的血管通透性和肿瘤细胞血管内为理解转移重要。理解血管通透性，肿瘤细胞血管内和在肿瘤微环境的多细胞相互作用的基本信令机制的动力学可提供在抗癌疗法的开发和管理的关键信息。

研究体内肿瘤血管通透性的主要手段一直是血管外染料的测量，如伊文思蓝^2，高分子量的葡聚糖（155 kDa）的染料注射后³和荧光团或放射性缀合的蛋白质（包括白蛋白^）4在固定的时间点。在显微镜的进步，动物模型和荧光染料已通过活体显微镜⁵启用细胞过程和在活体动物血管通透性的可视化。

活的动物成像采集静态图像，或短的时间推移的序列在数个时间点不允许在肿瘤微环境^6,7-动态事件的完整的理解。实际上，静态图像采集在24小时的过程中显示，肿瘤血管是漏水，但血管通透性的动力学没有观察到^6。因此，延长的持续时间推移成像长达12小时捕获在肿瘤微环境动态事件的动力学。

本协议描述使用较长时间推移multiphot的关于活体显微镜来研究在肿瘤微环境动态多细胞事件。在肿瘤微环境多种细胞类型标记有可注射的染料或通过使用表达荧光蛋白的转基因动物。使用尾静脉导管的血管的染料或蛋白质可成像开始之后被注入以获得在肿瘤微环境的多细胞事件的动力学数据。活细胞成像的乳腺肿瘤是通过手术准备一个皮瓣露出。图像被获取用于使用配备有多个光电倍增管（PMT）探测器⁸多光子显微镜长达12小时。通过使用适当的过滤器，减法算法使4 PMT检测器获取在肿瘤微环境同时⁹ 5的荧光信号。高分辨率多光子活体显微镜捕获在肿瘤微环境肿瘤 - 基质相互作用的单细胞分辨率成像，从而导致更好ü血管通透性和肿瘤细胞血管内^10-13的nderstanding。具体地，扩展的活体成像显露高度局部，瞬态血管通透性，在肿瘤细胞，巨噬细胞和内皮细胞之间的相互作用的位点选择性地发生的事件（定义为转移，TMEM ¹⁴的肿瘤微环境^）13。此外，肿瘤细胞血管内仅在TMEM发生和与血管通透性¹³被空间和时间上相关。这些事件的动态单细胞分辨率是通过在肿瘤微环境中使用荧光标记的细胞的延长的时间推移多光子显微镜的成为可能。

研究方案

中描述的所有程序必须按照与使用脊椎动物，包括医药机构动物护理和使用委员会的爱因斯坦医学院的事先批准的准则和规定进行。

1.生成荧光标记的肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞

1. 通过杂交自发，原地，遗传工程小鼠乳腺癌模型中，小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复与荧光报告[ 即转基因小鼠驱动多瘤中间T抗原（MMTV-PyMT），增强型绿色荧光产生的荧光标记的肿瘤细胞蛋白（EGFP），增强型青色荧光蛋白（ECFP）或者Dendra2] ^-8,9-。
2. 在PyMT动物荧光标记的巨噬细胞用荧光通过穿越myeloid-和巨噬细胞特异性荧光记者遗传工程小鼠模型[即 MacGr标记的肿瘤细胞EEN ¹⁵或MacBlue小鼠CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16]。
3. 可替代地，通过荧光标记PyMT肿瘤细胞（同基因），人乳腺癌细胞系或原代人类患者来源的肿瘤（异种移植物^）11,17的原位移植产生荧光标记的肿瘤。
   1. 植入荧光标记PyMT肿瘤细胞与荧光蛋白标记的骨髓细胞同系小鼠以生成具有荧光标记的肿瘤细胞和骨髓细胞¹³的动物。
4. 注入100微升的10毫克/公斤的荧光70 kDa的葡聚糖通过静脉内（IV）尾静脉进入重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠与人细胞系或来源于患者的原发肿瘤荧光标记的巨噬细胞2小时之前开始的异种移植肿瘤的活体成像。

2.显微镜设置和成像准备

注:此过程描述的设立对多光子显微镜⁸活体成像。

1. 打开所有显微镜和激光组件，包括双光子激光器和检测器。
2. 打开加热框到30℃预温阶段。这个步骤是用于维持动物的生理温度是至关重要的。
3. 有关倒置显微镜的地方在显微镜舞台上的定制阶段插入使用。自定义插入是"加工成适合在舞台插入空间和一个1厚铝"直径的通孔的中心成像的1/8片。
   1. 擦拭用70％乙醇和空气干燥的显微镜载物台和阶段插入。
   2. 放置在20X，1.05 NA显微镜物镜一大滴的水，以保持与玻璃盖光学接触。
   3. 地方盖玻璃（＃1.5厚度）在显微镜舞台上插入成像端口。安全与实验室胶带的地方。
   4. 用打孔器打孔2厘米×2厘米的洞以灵活的橡胶垫，并将与在自定义阶段插入孔对准垫孔显微镜阶段的橡胶垫。

3.尾静脉导管的制备及试剂成像注射期间

1. 切聚乙烯（PE）管30厘米长。
2. 使用镊子，移动31克针金属针来回，直到它打破关闭塑料接头的。
3. 使用镊子，插入分离针的钝端进入PE管材。
4. 插入一个31克针进入PE管的另一端。
5. 填用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）1毫升注射器，并将其插入到31克针和刷新所有空气从管和针用PBS中。 PBS用于维护水合和血液的渗透压^9,18，也可以使用然而等渗盐水。
6. 填用200μl的3毫克1毫升注射器/ kg的155 kDa的葡聚糖 - 四甲基罗丹明（TMR）或血管标记的量子点。
7. 制备任何其它可注射的蛋白质，例如在1毫升注射器置于冰上血管内皮生长因子A（VEGFA _165）的一个165氨基酸同种型。注入0.2毫克/千克VEGFA ₁₆₅ ¹⁹以0.05毫克/毫升的浓度。

4.插入尾留置静脉置管

1. 使用感应腔室与O ₂作为载气的5％异氟烷放置麻醉下的动物。
2. 鼠标转移到外科平台一旦完全麻醉，并且不向脚趾捏响应。
3. 开异氟烷麻醉线到外科平台，关闭麻醉线到感应腔室，并放置在动物的鼻子的鼻锥体。从5％减小异氟醚为2.5％。
4. 应用眼药膏鼠标，以防止在麻醉过程中干涩的眼睛。
5. 热的加热灯下动物另外的2分钟，以增加流通尾巴作为循环深麻醉放缓。
6. 消毒用70％乙醇的小鼠尾静脉。
7. 插入从第3节中构建到动物的侧面尾静脉导管的31克针尖和推针在2-3毫米。
8. 向后拉动注射器见血，确保导管放置在尾静脉中。
9. 使用放置在针实验室带的1cm长，以代替平行针保持沿尾部的长度的静脉。

5.皮瓣手术过程揭露乳腺肿瘤

1. 与手术平台上的动物拭肿瘤并用70％乙醇腹面。注意:如所描述的，不进行该过程完全在无菌条件下。对于长成像会议，其中感染可成为一个混杂因素，建议使用正确的无菌技术。
2. 用免缝勒镊子，提起腹侧皮肤，并用无菌剪刀使一个皮下切口沿腹中线大约为1厘米的长度。避免切口时刺破腹膜。
3. 轻轻切结缔组织附着的乳腺肿瘤从腹膜掉，露出乳房肿瘤。
4. 用剪刀和镊子，轻轻取出，并从肿瘤的暴露表面切去筋膜和脂肪，同时保持肿瘤脉管系统的完整性和减少出血。这一步骤是在维持肿瘤的肿瘤架构和脉管供应的关键。

6.动物准备显微镜

1. 动物转移到预热的成像级与暴露的肿瘤放置在盖玻片上的阶段插入在用于成像的显微镜物镜。照顾到与动物轻轻转移尾静脉导管，以便不去除针头。
2. 第广场Ë麻醉鼻锥在动物的鼻子，以保持麻醉盘以3％异氟醚。
3. 使肿​​瘤掌握在橡胶垫的孔，并与该玻璃盖玻片接触动物的位置。
4. 用两个橡胶垫到位轻轻握住肿瘤，并将其固定在显微镜阶段，实验室的磁带，以减少图像采集过程中的运动。
5. 填补用PBS橡胶垫的腔室，以保持组织水合和保持与盖玻片光学接触。
6. 开始脉搏血氧仪探头监测动物的生命体征。附加的夹子传感器动物的大腿。备选地，可以使用被配置为套在脖子上的套环。
7. 放置加热箱在动物保持^30℃20。
8. 异氟醚的水平慢慢降低到0.5-1％维持麻醉，维持血流。

7.图像采集和Fluoresc注射耳鼻喉科染料和注射蛋白质

1. 使用显微镜目镜聚焦于肿瘤的表面上的荧光肿瘤细胞。
2. 通过用流动的血管发现区域选择感兴趣的区域。感兴趣的区域的与流血管的选择是用于评估肿瘤血管的关键。
3. 一旦感兴趣区域已被选择切换显微镜到多光子成像模式。
4. 设置Z系列的上限和下限。通过使用焦点调整到目标移动到所需的开始位置和点击的Z位置"顶部"按钮组的z系列的上限。通过在二次谐波产生（SHG）信道的肿瘤表面可视化胶原纤维网络并当无细胞，但只胶原纤维是可见的观测确定的z系列的上限。
   1. 由物镜移动到所希望的成像深度设置Z系列的下限（typicaLLY 50 - 150微米），并单击Z位置"底部"按钮。
   2. 通过键入所需的值到步长字段设置为步长。确定基于考虑分辨率和采集时间步长（通常为2微米，用于高分辨率三维重建和5微米其他）。
5. 通过切换到时间推移面板和输入所需的经过时间进入时间推移字段中设置的时间推移的时间间隔。为获得最佳的时间分辨率的时间间隔设置为0秒，连续成像。注意:对于长期延时成像建议的时间间隔设置为10秒采集之间以补充目标浸没液体。
6. 一旦成像参数已经确定，缓缓注入155 kDa的葡聚糖TMR。
   1. 在尾静脉导管除去，用PBS注射器，用含155 kDa的葡聚糖的TMR注意不要引入任何气泡进入里注射器替换东北。
   2. 缓缓注入155 kDa的葡聚糖的TMR到小鼠，用200μl的最大体积，并用含有PBS注射器更换注射器。关键的一步:慢慢进行注射，并采取预防措施，以避免让静脉以外的解决方案。
7. 通过点击的Z-Stack和时间流逝按钮来抑制它们，然后点击录制按钮开始采集的Z堆叠延时成像。
8. 如果其它荧光葡聚糖， 即 10 kDa的葡聚糖-荧光素异硫氰酸酯（FITC），或蛋白质， 即 ，VEGFA _165，已事先准备，图像采集在= 0分钟开始开始后注入它们。
   1. 在尾静脉导管除去，用PBS注射器，用含10 kDa的葡聚糖-FITC或VEGFA ₁₆₅注意不要引入任何气泡进入线注射器替换。
   2. 通过尾静脉导管缓缓注入注射到小鼠和替换用含有PBS中的注射器的注射器。
9. 每30-45分钟，慢慢注入50μl的PBS或生理盐水，以保持动物的水合。

8.安乐死

1. 在图像采集的终止，安乐死的动物。
   1. 增加异氟烷％至5％。
   2. 保持5％异氟醚下的动物，直到30秒它停止呼吸，从舞台上拆下后的动物。
   3. 执行颈椎脱位，以确保完全安乐死。

9.图像处理

1. 获得在16位TIFF文件的图像在每个时间点每个单独的信道，并依次保存。
2. 执行频谱重叠（ 即绿色荧光蛋白和CFP），消除XY漂移和电影的使用ImageJ的中^9条设立的方法时间推移序列产生的分离。进行高分辨率图像¹³的三维表面重建。

结果

延长的时间推移活体显微镜使在肿瘤微环境的多细胞过程的单细胞分辨率的成像。通过荧光标记的肿瘤细胞，巨噬细胞，血管空间和可视化使用二次谐波生成信号的胶原纤维网络，在肿瘤微环境多个隔间成像期间被同时跟踪。标记的荧光蛋白的肿瘤细胞可以在转基因小鼠如已在MMTV-PyMT-Dendra2小鼠已经完成，用标记与Dendra2（ 图1A）的乳腺肿瘤细胞中产生。通过?...

讨论

在肿瘤微环境自发发生的细胞相互作用可以导致肿瘤细胞运动和血管内的变化。活肿瘤组织的高分辨率活体成像允许多细胞动力学，可以是高瞬态^10,13,24的可视化。终点与分立时间点获取的可提供的在肿瘤微环境的过程的分子机制的基本信息体内测定或时间推移的图像。活体成像的研究已经被用于研究在肿瘤微环境中发生的数天的过程，生成对血管生成，肿瘤细胞迁移和响应...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch