Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.

Abstract

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

Introduzione

Diffusione di cellule tumorali dal tumore mammario primario ha dimostrato di coinvolgere non solo le cellule tumorali, ma ospitare cellule stromali compresi macrofagi e cellule endoteliali. Inoltre, il tumore vascolare è anormale con aumento della permeabilità ^1. Così, determinare come le cellule tumorali, macrofagi e cellule endoteliali interagiscono per mediare la permeabilità vascolare e intravasation delle cellule tumorali nel microambiente tumorale primaria è importante per la comprensione delle metastasi. Comprendere la cinetica della permeabilità vascolare, intravasation delle cellule tumorali e il meccanismo di segnalazione alla base delle interazioni multicellulari nel microambiente tumorale in grado di fornire informazioni cruciali per lo sviluppo e la gestione delle terapie anti-cancro.

I mezzi primari di studiare tumore permeabilità vascolare in vivo è stata la misura di coloranti extravascolare come Evans blue ^2, destrani ad alto peso molecolare (155 kDa)³ e fluoroforo o proteine ​​radiotracciante coniugato (tra cui l'albumina) ⁴ in punti fissi di tempo dopo l'iniezione del colorante. I progressi nella microscopia, modelli animali e coloranti fluorescenti hanno permesso la visualizzazione dei processi cellulari e permeabilità vascolare di animali vivi attraverso la microscopia intravitale ^5.

Immagini di animali vivi con l'acquisizione di immagini statiche, o sequenze di breve time-lapse in diversi punti di tempo non permette la completa comprensione di eventi dinamici nel microambiente tumorale ^6,7. Infatti, l'acquisizione di immagini statiche nel corso di 24 ore ha dimostrato che tumore vascolarizzazione è a tenuta, tuttavia la dinamica della permeabilità vascolare non è stata osservata ^6. Così, lungo l'imaging continuo time-lapse fino a 12 ore cattura la cinetica di eventi dinamici nel microambiente tumorale.

Questo protocollo descrive l'uso di prolungato multiphot time-lapsesulla microscopia intravitale per studiare eventi multicellulari dinamici nel microambiente tumorale. Più tipi di cellule del microambiente tumorale sono etichettati con coloranti iniettabili o utilizzando animali transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti. Utilizzando un catetere venoso coda coloranti vascolari o proteine ​​possono essere iniettati dopo l'inizio di imaging per acquisire dati cinetici di eventi multicellulari nel microambiente tumorale. Per l'imaging cellulare dal vivo il tumore mammario è esposta attraverso la preparazione chirurgica di un lembo cutaneo. Le immagini vengono acquisite fino a 12 ore utilizzando un microscopio multiphoton dotato di molteplici tubi fotomoltiplicatori (PMT) rilevatori ^8. Utilizzando opportuni filtri, un algoritmo di sottrazione consente 4 rivelatori PMT per acquisire 5 segnali fluorescenti nel microambiente tumorale contemporaneamente ^9. Ad alta risoluzione multiphoton intravitale microscopia cattura di imaging singola risoluzione delle cellule di interazioni tumore-stroma nel microambiente tumorale, portando ad una migliore understanding della permeabilità vascolare e del tumore delle cellule intravasation ^10-13. In particolare, rivelato altamente localizzati, transitori eventi permeabilità prolungati di imaging intravitale vascolari che si verificano selettivamente nei siti di interazione tra una cellula tumorale, un macrofago e una cellula endoteliale (definito come il microambiente tumorale delle metastasi, TMEM ^{14) 13.} Inoltre, intravasation cellule tumorali si verifica solo in TMEM ed è spazialmente e temporalmente correlata con la permeabilità vascolare ^13. risoluzione singola cella della dinamica di questi eventi è stato reso possibile attraverso l'utilizzo di prolungato time-lapse multifotonica microscopio di cellule fluorescente nel microambiente tumorale.

Protocollo

Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui la preventiva approvazione da parte del Albert Einstein College of Medicine Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso.

1. Generazione di fluorescenza Tumori etichettati e macrofagi associati al tumore

1. Generare cellule tumorali fluorescente attraversando il, autoctona, topo geneticamente modificato modello cancro mammario spontaneo in cui la ripetizione lungo terminale virus tumore del mouse mammaria spinge l'antigene polioma mezzo T (MMTV-PyMT) con i topi transgenici con i giornalisti fluorescenti [cioè, una maggiore verde fluorescente proteine ​​(EGFP), una maggiore proteina ciano fluorescente (ECFP) o Dendra2] ^8,9.
2. Macrofagi etichetta fluorescente negli animali PyMT con fluorescente cellule tumorali attraversando modelli di topo geneticamente con i giornalisti fluorescenti specifiche myeloid- e macrofagi [cioè, MacGreen ¹⁵ o topi MacBlue CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16].
3. In alternativa, generano fluorescente tumori attraverso il trapianto ortotopico di cellule fluorescente PyMT tumorali (singenici), linee di cellule umane di cancro al seno o tumori primari paziente umano derivati ​​(xenotrapianti) ^11,17.
   1. Implant fluorescente cellule tumorali PyMT in topi singenici con le cellule mieloidi fluorescenti proteina marcato per generare animali con cellule tumorali fluorescenza etichettati e cellule mieloidi ^13.
4. Iniettare 100 ml di 10 mg / kg fluorescente 70 kDa destrano per via endovenosa (iv) la coda vena in grave topi immunodeficienza combinata (SCID) con tumori xenotrapianto di linee cellulari umane o tumori primari del paziente di derivazione a macrofagi etichette fluorescenza 2 ore prima della partenza dell'imaging intravitale.

2. Installazione Microscopio e Imaging Preparazione

Nota: Questa procedura descrive il set-upper l'imaging intravitale su un microscopio multiphoton ^8.

1. Accendere tutti i componenti del microscopio e laser, tra cui laser a due fotoni e rivelatori.
2. Selezionare la casella di riscaldamento a 30 ° C per pre-riscaldare il palco. Questo passaggio è fondamentale per il mantenimento della temperatura fisiologica dell'animale.
3. Per l'uso su un posto microscopio invertito la fase di inserimento su misura sul palco microscopio. L'inserto personalizzato è un foglio di 1/8 "in alluminio di spessore lavorato per adattarsi allo spazio inserto palco e con un 1" di diametro foro passante nel centro per l'imaging.
   1. Pulire la fase di microscopio e l'inserto palco con il 70% di etanolo e aria secca.
   2. Mettere un grande goccia d'acqua sulla NA obiettivo 20X, 1,05 microscopio per mantenere il contatto ottico con il vetro di copertura.
   3. Bicchiere coperchio (# 1.5 spessore) sulla porta di imaging sull'inserto palco microscopio. Fissare in posizione con nastro adesivo di laboratorio.
   4. Utilizzare un pugno buco per fare un buco due centimetri x 2 cmin un pad in gomma flessibile e posizionare il gommino sul palco microscopio con il foro del pad allineato con il foro dell'inserto fase personalizzato.

3. Preparazione della vena della coda catetere e reagenti per iniezione durante Imaging

1. Tagliare una lunghezza di 30 cm in polietilene (PE) tubo.
2. Utilizzando pinze, spostare l'ago metallico di un ago G 31 avanti e indietro finché non si rompe fuori del raccordo di plastica.
3. Utilizzando pinze, inserire l'estremità smussata dell'ago distaccata nel tubo PE.
4. Inserire un ago G 31 nell'altra estremità del tubo PE.
5. Riempire una siringa da 1 cc con fosfato sterile salina tamponata (PBS) e inserirlo nel ago G 31 e lavare tutta l'aria dal tubo e ago con PBS. PBS è usato per mantenere l'idratazione e osmolarità del sangue ^9,18, soluzione salina isotonica tuttavia possono anche essere utilizzati.
6. Riempire una siringa da 1 cc con 200 ml di 3 mg / kg 155 kDa destrano-tetramethylrhodamine (TMR) O punti quantici per l'etichettatura vascolare.
7. Preparare eventuali altre proteine ​​iniettabili come ad esempio un acido amino 165 isoforma del fattore di crescita vascolare endoteliale A (VEGFA ₁₆₅₎ in una siringa da 1 cc e posto sul ghiaccio. Iniettare 0,2 mg / kg VEGFA ₁₆₅ ¹⁹ alla concentrazione di 0,05 mg / ml.

4. Inserimento della coda Indwelling Vena catetere

1. Posto l'animale in anestesia utilizzando una camera di induzione con 5% isoflurano con O ₂ come gas di trasporto.
2. Trasferire il mouse per la piattaforma chirurgica una volta che è completamente anestetizzato e non risponde ad un pizzico dito del piede.
3. Linea aperta isoflurano alla piattaforma chirurgica, chiudere la linea anestesia alla camera di induzione e posizionare il cono sopra muso dell'animale. Ridurre il isoflurano dal 5% al ​​2,5%.
4. Applicare una pomata oftalmica agli occhi del mouse per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
5. Scaldare l'animale sotto la lampada di riscaldamentoper altri 2 minuti per aumentare la circolazione nella coda come circolazione rallenta con anestesia profonda.
6. Sterilizzare la vena della coda del mouse con il 70% di etanolo.
7. Inserire la punta di un ago G 31 dal catetere costruito nella Sezione 3 nella vena caudale laterale dell'animale e spingere l'ago 2-3 mm.
8. Tirare indietro sulla siringa per vedere il sangue, garantendo il catetere viene inserito nella vena della coda.
9. Utilizzare una lunghezza 1 cm di nastro lab posto sopra l'ago per mantenere l'ago in posizione parallelamente alla vena lungo la lunghezza della coda.

5. Pelle Flap procedura chirurgica per esporre il tumore mammario

1. Con l'animale sulla piattaforma chirurgica tamponare il tumore e la superficie ventrale con il 70% di etanolo. Nota: Come descritto, questa procedura non viene eseguita completamente asettico. Per le sessioni lunghe di imaging in cui l'infezione può diventare un fattore di confusione, si consiglia di utilizzare una corretta tecnica asettica.
2. utilizzando steriLe pinze, sollevare la pelle ventrale e con le forbici sterili fanno un'incisione sottocutaneo lungo la linea mediana ventrale di circa 1 cm di lunghezza. Evitare la puntura del peritoneo durante l'incisione.
3. Delicatamente tagliare il tessuto connettivo fissare la ghiandola mammaria e tumori lontano dal peritoneo per esporre il tumore mammario.
4. Usando forbici e pinze, rimuovere delicatamente e tagliare via la fascia e grasso dalla superficie esposta del tumore mantenendo l'integrità del sistema vascolare del tumore e minimizzando sanguinamento. Questo passaggio è fondamentale nel mantenere l'architettura tumore e vascolarizzazione fornitura del tumore.

6. Preparazione degli animali per la microscopia

1. Trasferire l'animale alla fase di imaging pre-riscaldato con il tumore esposta collocato sul vetrino sull'inserto palcoscenico sul obiettivo microscopio per l'imaging. Fare attenzione a trasferire il catetere vena della coda delicatamente con l'animale in modo da non staccare l'ago.
2. ° postoe anestesia naso cono sopra il muso dell'animale per mantenere insieme l'anestesia al 3% isoflurano.
3. Posizionare l'animale in modo che il tumore poggia nel foro del gommino ed entra in contatto con il vetro coprioggetto.
4. Utilizzare due tamponi in gomma per tenere delicatamente il tumore al suo posto e fissarli al palco microscopio con del nastro laboratorio per ridurre il movimento durante l'acquisizione dell'immagine.
5. Riempire la camera dal pad di gomma con PBS per mantenere il tessuto idratato e mantenere il contatto ottico con il vetrino.
6. Inizia il monitoraggio dei segni vitali dell'animale con una sonda pulsossimetro. Collegare un sensore clip alla coscia dell'animale. In alternativa un collare che è configurato per adattarsi intorno al collo può essere utilizzato.
7. Posizionare la scatola del riscaldamento sopra l'animale per mantenere 30 ° C ^20.
8. Lentamente ridurre il livello di isoflurano al 0,5-1% per mantenere l'anestesia e mantenere il flusso sanguigno.

7. Acquisizione di immagini e l'iniezione di flent Coloranti e iniettabili Proteine

1. Utilizzando il fuoco del microscopio oculare sulle cellule tumorali fluorescenti sulla superficie del tumore.
2. Selezionare un'area di interesse trovando zone con che scorre i vasi sanguigni. La selezione di una zona di interesse con scorre vasi sanguigni è critico per valutare vasi tumorali.
3. Una volta che è stata selezionata una regione di interesse passare al microscopio in modalità di imaging multiphoton.
4. Impostare i limiti superiore e inferiore di una serie z. Impostare il limite superiore della serie Z utilizzando il regolatore di messa a fuoco per spostare l'obiettivo nella posizione di partenza desiderato e facendo clic sul pulsante di posizione Z "Top". Determinare il limite superiore della serie Z visualizzando la rete in fibra di collagene sulla superficie del tumore nel canale generazione di seconda armonica (SHG) e osservando quando nessuna cellula ma solo fibre di collagene sono visibili.
   1. Impostare il limite inferiore della serie Z spostando l'obiettivo alla profondità di imaging desiderata (typically 50 - 150 micron) e il tasto "basso" cliccando la posizione Z.
   2. Impostare la dimensione del passo digitando il valore desiderato nel campo dimensione del passo. Determinare dimensione del passo sulla base di considerazioni di risoluzione e tempo di acquisizione (in genere 2 micron viene utilizzato per la ricostruzione 3D ad alta risoluzione e 5 micron altro).
5. Impostare l'intervallo di time-lapse passando al pannello Time-Lapse e inserendo il lasso di tempo desiderato nel campo Time-Lapse. Per risoluzione temporale ottimale impostare l'intervallo di tempo a 0 sec per l'imaging continuo. Nota: Per lungo time-lapse imaging si consiglia di impostare l'intervallo di tempo di 10 secondi tra le acquisizioni per ricostituire il liquido di immersione obiettivo.
6. Una volta che i parametri per l'imaging sono stati determinati, iniettare lentamente 155 kDa destrano-TMR.
   1. Rimuovere la siringa con PBS nel catetere coda vena e sostituirlo con la siringa contenente 155 kDa destrano-TMR facendo attenzione a non introdurre bolle nel Line.
   2. Iniettare lentamente 155 kDa destrano-TMR nel mouse, con un volume massimo di 200 ml, e sostituire la siringa con siringa contenente PBS. PUNTO CRITICO: eseguire l'iniezione lentamente e prendere precauzioni per evitare di ottenere una soluzione al di fuori della vena.
7. Avviare l'acquisizione del time-lapse imaging Z-stack facendo clic sui pulsanti Time-lapse Z-Stack e per deprimere loro e poi cliccando sul pulsante di registrazione.
8. Se altri destrani fluorescenti, vale a dire, isotiocianato 10 kDa destrano-fluoresceina (FITC), o le proteine, cioè, VEGFA _165, sono stati preparati in anticipo, li iniettare dopo l'inizio di acquisizione di immagini per a = 0 min inizio.
   1. Rimuovere la siringa con PBS nella vena della coda del catetere e sostituirlo con la siringa contenente 10 kDa destrano-FITC o VEGFA ₁₆₅ facendo attenzione a non introdurre bolle nella linea.
   2. Iniettare lentamente iniettabili nel mouse attraverso il catetere vena della codae sostituire la siringa con una siringa contenente PBS.
9. Ogni 30-45 min, iniettare lentamente 50 ml di PBS o soluzione salina per mantenere l'idratazione dell'animale.

8. L'eutanasia

1. Al termine della acquisizione delle immagini, eutanasia dell'animale.
   1. Aumentare la isoflurano al 5%.
   2. Mantenere l'animale sotto il 5% isoflurano fino al 30 sec dopo che cessa di respirare e rimuovere l'animale dal palco.
   3. Eseguire dislocazione cervicale per garantire la completa eutanasia.

Processing 9. Immagine

1. Acquisire le immagini in file TIFF a 16 bit per ogni singolo canale ad ogni tempo e salvare in modo sequenziale.
2. Eseguire la separazione di sovrapposizione spettrale (cioè, GFP e PCP), l'eliminazione di deriva xy e la generazione di film da sequenze time-lapse con metodi stabiliti in ImageJ ^9. Eseguire ricostruzioni di superficie 3D di immagini ad alta risoluzione ¹³.

Risultati

Esteso microscopia time-lapse intravitale permette l'imaging singola cella risoluzione dei processi multicellulari nel microambiente tumorale. Da parte delle cellule tumorali fluorescenza etichettatura, i macrofagi, lo spazio vascolare, e visualizzare la rete di fibre di collagene con il secondo segnale di generazione di armoniche, comparti multipli nel microambiente tumorale sono contemporaneamente monitorati durante l'imaging. Le cellule tumorali marcate con proteine ​​fluo...

Discussione

interazioni cellulari che si verificano spontaneamente nel microambiente tumorale possono portare a cambiamenti nella motilità delle cellule tumorali e intravasation. High-Resolution Imaging intravitale del tessuto tumorale dal vivo permette la visualizzazione delle dinamiche pluricellulari che possono essere ^10,13,24 altamente transitorio. End-point in vivo o immagini time-lapse acquisiti con i punti di tempo discreto grado di fornire informazioni essenziali sui meccanismi molecolari dei processi n...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch