Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

Resumo

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.

Resumo

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

Introdução

Divulgação de células tumorais a partir do tumor mamário primário tem sido demonstrado que envolvem as células de tumor não apenas, mas células hospedeiras estromais incluindo macrófagos e células endoteliais. Além disso, a vasculatura tumoral é anormal, com ^um aumento da permeabilidade. Assim, determinar como células tumorais, macrófagos e células endoteliais interagem para mediar a permeabilidade vascular e intravasamento célula tumoral no microambiente do tumor primário é importante para a metástase compreensão. Compreendendo a cinética da permeabilidade vascular, intravasamento de células tumorais e o mecanismo de sinalização subjacente de interacções multicelulares no microambiente tumoral pode fornecer a informação crucial no desenvolvimento e administração de terapias anti-cancerosas.

O principal meio de estudar a permeabilidade vascular do tumor in vivo tem sido a medição de corantes extravasculares, tais como azul de Evans ^2, dextranos de elevado peso molecular (155 kDa)³ e fluoróforo ou proteínas radiofármaco-conjugados (incluindo a albumina) ⁴ em pontos fixos de tempo após a injecção do corante. Avanços na microscopia, modelos animais e corantes fluorescentes permitiram a visualização de processos celulares e permeabilidade vascular em animais vivos por meio de microscopia intravital ^5.

Imaging animal vivo com a aquisição de imagens estáticas, ou sequências de curto lapso de tempo ao longo de vários pontos de tempo não permite a compreensão completa dos eventos dinâmicos no microambiente do tumor ^6,7. De facto, a aquisição de imagem estática ao longo de 24 horas demonstraram que a vasculatura tumoral é permeável, no entanto, a dinâmica da permeabilidade vascular não foi observada ^6. Assim, estendido de imagem contínua de lapso de tempo de até 12 horas capta a cinética de eventos dinâmicos no microambiente do tumor.

Este protocolo descreve o uso de estendido multiphot time-lapseem microscopia intravital para estudar eventos multicelulares dinâmicos no microambiente tumoral. Vários tipos de células no microambiente do tumor são marcadas com corantes injectáveis ​​ou usando animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes. Utilizando um cateter na veia da cauda corantes vasculares ou proteínas pode ser injectado após o início da imagiologia para adquirir dados de cinética de eventos multicelulares no microambiente tumoral. Para imagens de células vivas do tumor mamário é exposto através da preparação cirúrgica de um retalho de pele. As imagens são adquiridas por até 12 horas usando um microscópio multiphoton equipado com múltiplos tubos fotomultiplicadores (PMT) detectores ^8. Ao usar filtros apropriados, um algoritmo de subtracção possibilita 4 detectores PMT para adquirir sinais fluorescentes 5 no microambiente tumoral, simultaneamente ^9. microscopia de alta resolução multiphoton intravital captura de imagem resolução única célula de interações tumor-estroma no microambiente tumoral, levando a uma melhor understanding da permeabilidade vascular e intravasamento célula tumoral ^10-13. Especificamente, imagiologia intravital reveladas altamente localizadas transientes, eventos de permeabilidade vascular estendidos que ocorrem selectivamente em locais de interacção entre uma célula tumoral, um macrófago e uma célula endotelial (definido como o microambiente do tumor de metástase, TMEM ^{14) 13.} Além disso, intravasation células tumorais ocorre apenas em TMEM e é espacialmente e temporalmente correlacionada com a permeabilidade vascular ^13. resolução única célula da dinâmica destes eventos foi possível através do uso de microscopia multiphoton lapso de tempo prolongado de células com marcação fluorescente no microambiente tumoral.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia do Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care e do Comitê Use.

1. Geração de fluorescência Tumores marcados e macrófagos associados a tumores

1. Gerar células tumorais com marcação fluorescente, atravessando o autóctone rato geneticamente modelo espontânea, mamária câncer de onde o mouse mamária vírus do tumor repetição terminal longa impulsiona o antígeno polioma meio T (MMTV-PyMT) com camundongos transgênicos com repórteres fluorescentes [isto é, reforçada verde fluorescente proteínas (EGFP), reforçada proteína ciano fluorescente (ECFP) ou Dendra2] ^8,9.
2. Macrófagos etiqueta fluorescente em animais PyMT com fluorescente etiquetado células tumorais através do cruzamento modelos de ratos geneticamente modificadas com repórteres fluorescentes específicos myeloid- e macrófago [ie, MacGreen ¹⁵ ou ratos MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16].
3. Alternativamente, geram fluorescente etiquetado tumores através de transplante ortotópico de células tumorais com marcação fluorescente PyMT (sing�icos), linhas celulares de cancro da mama humano ou tumores paciente humano derivados primários (xenoenxertos) ^11,17.
   1. Implante marcado por fluorescência de células tumorais em ratinhos singeneicos PyMT com células mielóides marcado com proteínas fluorescentes para gerar animais com células tumorais marcado por fluorescência e as células mielóides ^13.
4. Injectar 100 ul de 10 mg / kg fluorescente 70 kDa dextrano por via intravenosa (iv) na veia da cauda em ratinhos imunodeficiência combinada grave (SCID) com tumores de xenoenxerto de linhas de células humanas ou tumores primários derivados de paciente para macrófagos etiqueta fluorescente 2 h antes do início de imagens intravital.

2. Setup microscópio e Imagem Preparação

Nota: Este procedimento descreve o set-uppara geração de imagens intravital em um microscópio multiphoton ^8.

1. Ligue todos os componentes do microscópio e laser, incluindo lasers de dois fótons e os detectores.
2. Ligue a caixa de aquecimento a 30 ° C, para pré-aquecer o estágio. Este passo é essencial para manter a temperatura fisiológica do animal.
3. Para uso em um local microscópio invertido a inserção estágio feito por encomenda no palco microscópio. O acessório personalizado é uma folha de 1/8 "de espessura de alumínio usinado para caber no espaço fase de inserção e com um diâmetro 1" através de buracos no centro para a imagem latente.
   1. Limpe a platina do microscópio e inserção fase com 70% de etanol e seca ao ar.
   2. Coloque uma grande queda de água no 20X, 1,05 NA objetivo microscópio para manter contato óptico com a tampa de vidro.
   3. tampa de vidro Place (# 1.5 espessura) sobre o porto de imagem na inserção palco microscópio. Fixe no lugar com fita laboratório.
   4. Use um furador para perfurar de 2 cm x 2 cm, buraconuma almofada de borracha flexível e colocar a almofada de borracha sobre a platina do microscópio, com o furo no bloco alinhado com o orifício na inserção fase costume.

3. Preparação de cauda veia cateter e Reagentes para injecção durante o exame

1. Cortar um comprimento de 30 cm de tubagem de polietileno (PE).
2. Utilizando uma pinça, mover a agulha de metal de uma agulha G 31 e para trás até que ele quebra da montagem de plástico.
3. Usando pinças, inserir a extremidade cega da agulha individual para o tubo de PE.
4. Inserir uma agulha G 31 na outra extremidade do tubo de PE.
5. Encha uma seringa de 1 cc com fosfato de solução salina estéril tamponada (PBS) e inseri-lo na agulha G 31 e liberar todo o ar para fora do tubo e agulha com PBS. PBS é utilizado para manter a hidratação e a osmolaridade do sangue ^9,18, também pode ser usado solução salina isotónica no entanto.
6. Encha uma seringa de 1 cc com 200 ul de 3 mg / kg 155 kDa dextrano-tetrametilrodamina (TMR) Ou pontos quânticos para a rotulagem vascular.
7. Preparar todas as outras proteínas de injectáveis, tal como uma isoforma de 165 amino ácido de crescimento endotelial vascular, factor de A (VEGFA ₁₆₅₎ numa seringa de 1 cc e colocar em gelo. Injectar 0,2 mg / kg ₁₆₅ ¹⁹ VEGFA a uma concentração de 0,05 mg / ml.

4. Inserção da cauda Indwelling Vein Cateter

1. Colocar o animal sob anestesia utilizando uma câmara de indução com 5% de isoflurano com _O2 como gás de transporte.
2. Transferir o mouse para a plataforma cirúrgica, uma vez que está totalmente anestesiado e não responde a uma pitada dedo do pé.
3. Abrir linha anestesia com isoflurano para a plataforma cirúrgica, fechar a linha de anestesia para a câmara de indução e colocar o cone do nariz ao longo do focinho do animal. Reduzir o isoflurano de 5% a 2,5%.
4. Aplicar pomada oftálmica para os olhos do mouse para prevenir o ressecamento durante a anestesia.
5. Aqueça o animal sob a lâmpada de aquecimentodurante mais 2 min para aumentar a circulação na cauda como a circulação diminui com anestesia profunda.
6. Esterilizar a veia da cauda do rato com etanol a 70%.
7. Inserir a ponta da agulha de 31 G a partir do cateter construído na secção 3 para dentro da veia lateral da cauda do animal e empurrar a agulha em 2-3 mm.
8. Puxar para trás sobre a seringa para ver sangue, assegurando o cateter é colocado na veia da cauda.
9. Usar um comprimento de 1 cm de fita de laboratório colocada sobre a agulha para manter a agulha no lugar paralelo à veia ao longo do comprimento da cauda.

5. Pele Flap Procedimento cirúrgico para expor o tumor mamário

1. Com o animal na plataforma cirúrgica pincelar o tumor e a superfície ventral, com 70% de etanol. Nota: Como descrito, este procedimento não é realizado completamente assepticamente. Para as sessões de imagem longas onde a infecção pode se tornar um fator de confusão, é recomendado o uso de uma técnica asséptica adequada.
2. usando Sterile fórceps, levantar a pele ventral com tesouras e estéreis fazer uma incisão subcutânea ao longo da linha média ventral, aproximadamente 1 cm de comprimento. Evitar a perfuração do peritoneu durante a incisão.
3. Suavemente cortar o tecido conjuntivo fixação da glândula mamaria e do tumor para longe do peritoneu para expor o tumor mamário.
4. Usando fórceps e tesouras, remover suavemente e cortar a fáscia e gordura a partir da superfície exposta do tumor enquanto se mantém a integridade da vasculatura do tumor e minimizar o sangramento. Este passo é crítico na manutenção da arquitectura do tumor e vasculatura fornecimento do tumor.

6. Preparação animal de Microscopia

1. Transferir o animal para o estágio de imagem pré-aquecido com o tumor exposto colocado sobre a lamela na fase de inserção através da objectiva de microscópio para imagiologia. Tomar cuidado para transferir o cateter na veia da cauda suavemente com o animal, de modo a não deslocar a agulha.
2. º lugare anestesia nariz cone sobre o focinho do animal para manter o conjunto de anestesia para 3% isoflurano.
3. Posicione o animal para que o tumor repousa no buraco da almofada de borracha e faz contato com a lamela de vidro.
4. Use duas almofadas de borracha para segurar delicadamente o tumor no lugar e corrigi-los para o palco microscópio com fita laboratório para reduzir o movimento durante a aquisição de imagem.
5. Encha a câmara da almofada de borracha com PBS para manter o tecido hidratado e manter contato óptico com a lamela.
6. Começar a monitorar os sinais vitais do animal com uma sonda de oxímetro de pulso. Anexar um sensor de clipe para a coxa do animal. Alternativamente, um colar que é configurado para se ajustar em torno do pescoço pode ser utilizado.
7. Coloque a caixa de aquecimento sobre o animal para manter 30 ° C ^20.
8. Lentamente reduzir o nível de isoflurano para 0,5-1% para manutenção da anestesia e manter o fluxo de sangue.

7. Aquisição de Imagem e injeção de fluoresent Corantes e Proteínas injectáveis

1. Utilizando o microscópio de focagem ocular sobre as células tumorais fluorescentes sobre a superfície do tumor.
2. Selecione uma área de interesse por encontrar áreas com fluxo vasos sanguíneos. A selecção de uma área de interesse, com fluxo vasos sanguíneos é essencial para avaliar a vasculatura tumoral.
3. Uma vez que uma região de interesse tiver sido seleccionado alternar o microscópio no modo de imagiologia multifotônica.
4. Definir os limites superior e inferior de uma série z. Defina o limite superior da série z usando o ajustador de foco para mover o objetivo para o local de início desejada e clicando no botão posição Z "Top". Determinar o limite superior do Z-série através da visualização da rede de fibras de colagénio na superfície do tumor no canal de segunda geração harmónica (SHG) e observando-se quando não há células, mas apenas as fibras de colagénio são visíveis.
   1. Definir o limite inferior da série Z movendo o objectivo para a profundidade desejada de imagem (Typically 50 - 150 mm) e clicando no botão posição Z "Bottom".
   2. Defina o tamanho do passo digitando o valor desejado no campo de tamanho do passo. Determinar o tamanho do passo com base em considerações de resolução e tempo de aquisição (normalmente 2 mm é utilizado para reconstrução 3D de alta resolução e 5 mm de outra forma).
5. Defina o intervalo de time-lapse, alternando para o painel de Time-Lapse e inserindo o lapso de tempo desejado no campo Time-Lapse. Para resolução temporal ideal definido o intervalo de tempo de 0 segundos para imagiologia contínua. Nota: Para longa de imagem time-lapse é recomendado para definir o intervalo de tempo para 10 seg entre as aquisições para repor o líquido de imersão objectivo.
6. Uma vez que os parâmetros de imagiologia têm sido determinado, injectar lentamente 155 kDa dextrano-TMR.
   1. Retirar a seringa com PBS no cateter na veia da cauda e substituir com a seringa contendo 155 kDa dextrano-TMR tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas no line.
   2. Lentamente injetar 155 kDa dextrano-TMR para o rato, com um volume máximo de 200 mL, e substituir a seringa com seringa contendo PBS. Passo crítico: Executar a injeção devagar e tomar as devidas precauções para evitar solução fora da veia.
7. Comece a aquisição do Z-stack imagens de lapso de tempo, clicando nos botões de lapso de tempo Z-Stack e para deprimir-los e, em seguida, clicar no botão de gravação.
8. Se outros dextranos fluorescentes, ou seja, isotiocianato de 10 kDa dextrano-fluoresceína (ITCF), ou proteínas, ou seja, VEGFA _165, foram preparados com antecedência, injetá-las após o início da aquisição da imagem para a = 0 min início.
   1. Retirar a seringa com PBS no cateter na veia da cauda e substituir com a seringa contendo 10 kDa dextrano-FITC ou VEGFA ₁₆₅ tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas na linha.
   2. Lentamente injetar injetáveis ​​no rato através do cateter na veia da caudae substituir a seringa com uma seringa contendo PBS.
9. Cada 30-45 minutos, injectam-se lentamente 50 mL de PBS ou soro fisiológico para manter a hidratação do animal.

8. A eutanásia

1. Ao término de aquisição de imagem, eutanásia do animal.
   1. Aumentar o isoflurano a 5%.
   2. Mantenha o animal com menos de 5% de isoflurano até 30 segundos depois ela deixa de respirar e remover o animal do palco.
   3. Realizar deslocamento cervical para assegurar a eutanásia completa.

Processamento 9. Imagem

1. Adquirir imagens em arquivos TIFF de 16 bits para cada canal individual em cada ponto de tempo e economizar sequencialmente.
2. Realizar a separação de sobreposição espectral (ou seja, GFP e PCP), a eliminação de deriva xy ea geração de filmes a partir de sequências de lapso de tempo usando métodos estabelecidos no ImageJ ^9. Executar reconstruções de superfície 3D de imagens de alta resolução ¹³.

Resultados

microscopia de lapso de tempo intravital estendida permite imagiologia resolução única célula de processos multicelulares no microambiente do tumor. Por células tumorais rotulagem fluorescente, macrófagos, do espaço vascular, e visualizando a rede de fibra de colagénio utilizando o segundo sinal de geração de harmónicas, vários compartimentos no microambiente tumoral são rastreados simultaneamente durante o exame. As células de tumor marcadas com proteínas fluorescentes po...

Discussão

interacções celulares que ocorrem espontaneamente no microambiente do tumor pode levar a alterações na motilidade de células tumorais e intravasamento. De alta resolução de imagem intravital do tecido tumoral ao vivo permite a visualização da dinâmica multicelulares que podem ser ^10,13,24 altamente transitória. Ponto final em ensaios in vivo ou imagens de lapso de tempo adquiridos com pontos de tempo discreto pode fornecer informações essenciais sobre mecanismos moleculares de p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch